TA的每日心情 | 2018-7-26 15:32 |
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Ras基因为一种癌基因,研究发现约有30%的恶性肿瘤中存在Ras基因突变,N-Ras基因属于Ras基因的家族成员,是由神经母细胞瘤DNA感染小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3而发现的。有研究发现N-Ras基因突变可导致黑色素瘤、甲状腺肿瘤、膀胱癌、恶性胶质瘤等疾病。有研究者采用大肠杆菌原核表达系统表达了N-Ras蛋白,并进行了纯化,为研究N-Ras基因影响肿瘤细胞的具体机制奠定了基础。
Ras蛋白是一种位于细胞膜内侧的信号传导小G蛋白,具有GTP酶活性,在细胞信号转导中起着重要的作用,Ras基因家族包括H- Ras、K- Ras和N- Ras三个结构类似的成员。正常的Ras蛋白具有调控细胞增殖和分化、调控细胞分裂周期、血管发生、整合蛋白信号和细胞存活等作用。而Ras基因激活则构成癌基因,在人类肿瘤中Ras基因激活方式包括基因点突变、基因大量突变、基因插入及转位,不同的Ras基因在不同的肿瘤中具有优势激活现象。如N-Ras突变主要存在于淋巴细胞白血病、急性髓系白血病等血液系统肿瘤中。为了获得足够的N-Ras蛋白来研究N-Ras基因突变与肿瘤的关系,有研究者进行了N-Ras的蛋白表达纯化研究。
1、N-Ras蛋白的原核表达研究
为了研究N-Ras蛋白的生物学活性,探讨N-Ras基因突变与肿瘤的关系,有研究者克隆了人N-ras蛋白全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化[1]。研究者采用原核表达系统表达了重组蛋白GST-N-Ras,并对重组蛋白进行了纯化,具体方法是采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人N-ras蛋白全长编码区基因,将其克隆到p GEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化化,SDS-PAGE鉴定表达与纯化产物。
结果从人乳腺文库中扩增获得约600 bp的DNA片段,并克隆至p GEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量约47×103的目的蛋白;纯化后,经鉴定获得了纯度较高的重组蛋白GST-N-Ras。该研究获得了重组蛋白GST-N-ras,为后续深入研究Ras基因与其他癌基因、抑癌基因的相互作用奠定了基础。
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。美迪西科研人员建立了成熟的大肠杆菌表达及纯化服务平台,提供包括各种重组蛋白以及其复合物在大肠杆菌中的表达与纯化服务。
N-Ras基因是Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/PTEN信号传导通路中重要的调控因子,而这些信号通路对细胞的生长、繁殖与分化具有重要的意义,N-Ras基因突变可以导致细胞持续生长,甚至肿瘤的发生。
2、N-Ras基因突变与黑色素瘤的关系
黑色素瘤是致死率较高的皮肤疾病,恶性程度极高,多见于西方国家。在2002年,有研究发现不同黑色素瘤患者基因“指纹”有差异。研究结果显示,不是日光照射引起的黑色素瘤(如脚底)的基因特征与日光照射引起的有区别。研究者发现,不是日光照射引起的黑色素瘤存在BRAF突变或N-RAS突变,而持续日光照射引起的黑色素瘤存在CKIT、CDK4、CCND1等“致癌基因”过量复制。这些发现提示, N-RAS突变存在与黑色素瘤中,在未来可以针对这些个性化基因通路开展靶向药物研究。
3、N-Ras基因突变与甲状腺肿瘤的关系
甲状腺癌是一种常见的甲状腺恶性肿瘤,对人体危害极大,甲状腺癌分子生物学研究是甲状腺癌靶向治疗的基础,与甲状腺癌发病密切相关的基因较具代表性的主要包括ret基因、Ras基因、BRAF基因和VEGR基因等。Ras基因编码产生一种GTP结合蛋白,在甲状腺癌中Ras基因突变产生有活性的转导蛋白,被认为是肿瘤发生的早期重要时间,其中N-Ras以及H-Ras基因突变占10%~20%。
Ras 基因突变是通过激活细胞信号转导途径,导致细胞异常增殖和凋亡受抑,从而导致 急性髓性白血病发生。研究表明约15%-30%的 AML 患者有 N-Ras 和 K-Ras 基因的突变, 而在正常人群中 RAS 的自然突变几乎检测不到。虽然N-ras表达水平上升虽然主要发生在造血系统的恶性肿瘤中,如APL、AML、BL,但在神经母细胞瘤、纤维肉瘤,横纹肌肉瘤中的表达也有一定的上升,并认为是这些肿瘤形成的主要原因。因此N-Ras基因突变与肿瘤的发生关系密切,采用原核表达系统表达N-Ras蛋白,并研究N-Ras基因突变对于了解肿瘤发生发展的作用,对于探索和研发治疗肿瘤的药物和方法,监测恶性肿瘤的治疗效果意义重大。
[1] 利用GST融合蛋白表达系统表达与纯化人N-Ras蛋白[J].
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