抑癌基因FLCN的蛋白表达纯化及与其与疾病的关系

FLCN是一个肿瘤抑制因子，当对年幼小鼠注入FLCN缺失的细胞株时，可以发现在小鼠内有肿瘤，重新注射野生型FLCN细胞株并在小鼠体内表达后，小鼠体内肿瘤又消失了，这证实了FLCN的肿瘤抑制作用。而且到目前为止，FLCN仍被认为是BHD综合征的主要诱发因子，进行FLCN蛋白表达纯化研究，可以为FLCN的结构与功能分子奠定了基础。

FLCN基因是在人、大鼠、牛、果蝇和酵母等多物种高度保守的蛋白质，采用原核表达系统可以进行FLCN蛋白表达纯化研究，来获取高质量、高纯度的FLCN蛋白，并进一步研究其生物学活性。

1、FLCN蛋白表达纯化研究

有研究者利用优化pGEX-6p-1-GST-FLCN重组质粒构建了大肠杆菌原核表达系统，诱导表达GST-FLCN融合蛋白，再通过GST介质亲和层析和分子筛纯化。最后通过Xa因子蛋白酶切除GST标签，收集获取了高纯度(90%左右)的FLCN蛋白，为FLCN的结构与功能分子奠定了基础[1]。利用表达载体制备重组蛋白，并通过重组蛋白表达纯化来获得大量有活性的重组蛋白，在生命科学研究和生物制品生产过程中至关重要。美迪西拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）和哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术，可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。

还有研究者基于优化的原核表达系统获取高质量、高纯度的FLCN蛋白，并对其进行结构解析，同时结合生物信息学方法进行结构预测分析[2]。研究者首先利用密码子偏爱性原则优化FLCN基因以适合大肠杆菌表达系统，构建ppSUMO-FLCN(Full length FL)、ppSUMO-N362（1-362a.a）重组质粒，转化至BL21宿主细胞诱导表达，高压破菌后利用镍亲和介质分离纯化（His）6-SUMO-FLCN融合蛋白，随后利用ULP1酶切除（His）6-SUMOTag，再进行二次镍亲和层析和分子筛层析后获取纯度90%以上的FLCN目的蛋白（N362纯度为65%，有待于进一步优化）。

也有研究者进行了人肿瘤抑制因子folliculin的N端结构原核表达纯化研究。研究者基于原核优化的FLCN基因构建N端1-362aa.(N362)的重组蛋白原核表达系统，在0.1mmol/LIPTG和16℃过夜诱导下融合蛋白(His)6-SUMO-N362高效表达，用镍亲和层析和离子交换层析纯化并用ULP1酶切除(His)6-SUMO标签后，可得到纯度高达80％的N362蛋白，这为后续FLCN的结构和功能分析奠定了良好基础[3]。用生物信息学技术对FLCN氨基酸序列预测，发现N端多无序区域且保守区域100-230aa.有强疏水性，极易形成疏水性片段，推测N端可能作为FLCN形成聚合体或转运结合的区域。

2、FLCN蛋白与BHD综合征的关系

BHD基因突变或缺失会诱发一种常染色体显性遗传病：BHD综合征，主要临床表现为毛囊错构瘤（头、脸、上部躯干等部位）、肺囊肿、自发性气胸及肾肿瘤等。其中肾肿瘤是BHD综合征相关的一类恶性肿瘤，是FLCN基因突变引起的，患有BHD综合征的患者有发生双侧、多灶性肾肿瘤的风险。

Folliculin（FLCN）是由BHD基因编码的肿瘤抑制因子。FLCN基因是在研究家族性肾嗜酸细胞瘤的遗传原因时发现的。在这些家族中，发现有双边、多病灶肾嗜酸细胞瘤的人也同样具有皮肤损伤，这些损伤在组织学上被证实为纤维毛囊瘤。通过在这些家族中以及其他引起的皮肤损伤的BHD综合症家族中进行的遗传连锁分析，随后定位克隆，发现了一个新基因FLCN，定位在17号染色体的断臂上，在BHD综合征患者的生殖细胞中发生了突变。

也有一些证据表明BHD家族中大部分FLCN突变都导致了FLCN蛋白的截断，表明失去功能的FLCN是导致BHD综合征的原因。研究者发现如果没有正常的FLCN，这些患者肺部的肺泡上皮细胞（AEC）开始死亡，导致肺部的孔洞随着细胞数量的增加而消失。这些洞穴可以充满空气并爆裂，导致肺部崩溃，80％至100％的BHD患者会在肺部形成多个孔或囊肿。

研究者还测试了小鼠肺II型肺泡上皮细胞中缺失的FLCN和在BHD和小鼠上皮细胞系统中都缺乏正常功能的突变FLCN，并将它们与正常人和小鼠对照细胞进行了比较。对照细胞显示正常的上皮结构，而突变的FLCN细胞显示出不规则和破坏的肺细胞结构。此外，BHD肺在II型肺泡上皮细胞中显示非常少的FLCN。

接下来，为了评估FLCN在肺中的作用，该团队用FLCN从小鼠中分离出肺泡上皮细胞，并在体外缺失该基因以显示细胞与细胞之间的相互作用减少和细胞通透性增加。他们还研究了AMPK在这些细胞中的活性，并发现细胞在没有FLCN的情况下死亡，因此没有正确激活AMPK。AMPK实际上是上皮细胞存活所必需的， FLCN的丢失或突变可以引发可以损害AMPK活化，上皮细胞与细胞相互作用和结构的反应，并因此促进细胞死亡。

因此BHD综合征是FLCN基因突变引起的，目前该疾病临床的明确诊断是检测FLCN突变是否具呈阳性。而进行FLCN蛋白表达纯化，可以为FLCN蛋白的生物学功能研究提供研究基础。

[1] 人肿瘤抑制因子Folliculin(FLCN)蛋白的原核表达纯化[J].

[2] 人肿瘤抑制因子Folliculin的原核表达、纯化及结构分析[J].

[3] 人肿瘤抑制因子folliculin的N端结构原核表达纯化[J].