体外测定药物对肿瘤细胞作用方法之集落形成法

当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆，每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。通过集落计数可以反映单个细胞的增殖潜力，所以能够较为灵敏地测定抗癌药的活性，可以用于具有抗癌作用的化合物活性筛选研究。集落形成法的常用试验有平板集落形成试验和软琼脂集落形成试验。

平板集落形成试验适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞，软琼脂集落形成试验适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。利用琼脂液无粘着性又可凝固的特性，将肿瘤细胞混入琼脂液中，琼脂液凝固使肿瘤细胞置于一定位置，琼脂中肿瘤细胞可能向周围作全方位的移动，因此可以用来检测肿瘤细胞的主动移动能力。肿瘤细胞在适宜培养基中又可以增殖，从而可以测定肿瘤细胞克隆形成率。将集落形成法技术用于药物活性测试，可以在体外测定药物的抗癌作用。上海美迪西的生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验，通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等，提供一套完整的生物学服务。

1、集落形成法可以从山梨猕猴桃根提取物中筛选抗肿瘤活性化合物

通过集落形成试验可以进行对肿瘤细胞具有抑制作用的化合物活性筛选研究。研究者从山梨猕猴桃根中筛选抗肿瘤活性成分，方法是采用MTT法、细胞集落形成法筛选山梨猕猴桃根提取物的抗肿瘤活性成分[1]。结果山梨猕猴桃根提取物用集落形成法R6，R8对胃癌细胞株SGC7901、白血病细胞株L1210、神经性肿瘤细胞株NG108—15、肝癌细胞株Bele7404的增殖有抑制作用；用MTT法对NG108—15，SGC7901的增殖有抑制作用。山梨猕猴桃根两种提取物（R5，R8）对脾淋巴细胞没有免疫毒性。因此山梨猕猴桃根提物R6，R8有抗肿瘤活性。

2、集落形成法可测定夜香树叶正丁醇提取物对胃癌细胞的作用

有研究者研究了夜香树(CN)叶正丁醇提取物中流份C6、C7对人胃癌细胞SGC7901增殖和凋亡的影响[2]。方法是采用不同比例的氯仿-甲醇(1∶9、1∶7)对CN叶正丁醇部位梯度洗脱，得到流份C6和C7。将SGC7901细胞分为空白对照组和C6、C7组。分别用0(空白对照)、5、10、20、40、80μg/ml的C6、C7培养SGC7901细胞72 h后采用MTT法检测其对细胞的增殖抑制作用，计算增殖抑制率、半数抑制浓度(IC50)；用10μg/ml C6、C7培养SGC7901细胞72 h后，采用集落形成法检测其对细胞的集落形成能力的影响，计算集落形成率；瑞氏-姬姆萨混染法、Hoechst 33258/碘化丙啶(PI)染色法观察细胞形态学变化。

结果MTT结果显示，流份C6、C7对SGC7901细胞增殖有不同程度的抑制作用，抑制率分别为22.1%~80.0%、19.6%~79.7%，IC50分别16.4、18.05μg/ml。与空白对照组比较，C6和C7组细胞的集落形成率降低，差异有统计学意义(P<0.05)；给药组细胞凋亡细胞、死细胞更多。因此CN叶正丁醇提取物中流份C6、C7可显著抑制SGC7901细胞增殖并诱导其凋亡。

在实际应用中，集落形成法大多用于肿瘤细胞的体外活性实验，可以用于体外筛选具有抗肿瘤活性的化合物。将集落形成法和其他细胞实验方法一起联用，是一项基本的用于抗肿瘤化合物活性筛选的方法。

[1] 山梨猕猴桃根提取物抗肿瘤活性研究[J].

[2] 夜香树叶正丁醇提取物中流份C6和C7对人胃癌细胞SGC7901增殖和凋亡作用的影响[J].