内皮抑素蛋白的表达及其对肿瘤细胞的作用研究

研究发现血管生成与肿瘤的生物学行为有关，是实体肿瘤发生、发展以及转移的关键，抑制肿瘤血管的形成成为了一种治疗肿瘤的方法。内皮细胞生长抑素，又称为内皮抑素，可以特异性地作用于内皮细胞，特别是能够抑制微血管内皮细胞的迁移、诱导其凋亡，其抗肿瘤活性也成为了医学界的研究热点。采用基因工程技术如酵母表达系统等可以进行内皮抑素的表达研究，来获得具有生物学的内皮抑制素蛋白来研究其生物学功能。大量的临床前动物实验研究表明，内皮抑制素具有抑制肿瘤细胞发生发展的作用。

内皮细胞抑制素(Endostatin)于1997年被O’Relly等研究者首先从小鼠血管内皮细胞瘤培养上清液中分离得到的，它可以特异性地抑制血管内皮细胞的生长，相对分子质量为20ku。作为目前肿瘤抗血管生产疗法中较有潜力的生物蛋白类药物，它可以特异性地抑制内皮细胞增生和迁移，对血管形成及肿瘤的生长呈明显抑制作用。医学界的众多学者开展了内皮细胞抑制素的蛋白表达和肿瘤治疗的研究，如采用酵母表达系统、大肠杆菌表达系统等基因工程技术来表达内皮细胞抑制素蛋白并研究其生物学活性。还有研究者进行了内皮抑制素基因和内皮抑制素蛋白对肿瘤细胞的作用研究。

1、        人内皮抑素的表达研究

（1）人内皮抑素的酵母表达研究

为获得大量具有生物学活性的重组人内皮抑素，研究者在毕赤酵母中进行了组成型表达的研究[1]。将由毕赤酵母偏爱密码子组成的Endostatin cDNA插入组成型载体pGAPZαA中，构建表达载体pGAPZαA-ENDO，并转化到毕赤酵母X-33中。重组菌株在甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子的调控作用下，进行组成型表达Endostatin蛋白。重组人Endostatin产量达到102mg/L。Western印迹分析结果显示:表达蛋白能与兔抗Endostatin的多克隆抗体特异性结合。纯化后的重组Endostatin具有抑制人血管内皮细胞系ECV-304细胞增殖的活性。利用毕赤酵母组成型表达系统能获得大量具有生物活性的Endostatin蛋白。

（2）人内皮抑素的大肠杆菌表达研究

有研究者采用大肠杆菌表达系统获得了具有生物学活性的人内皮抑素蛋白。方法才用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因，连接PGEM-T载体，测序确认，定向克隆入pBV220表达载体，转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定[2]。结果经测序分析证实，所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因，构建表达载体在大肠杆菌中表达，经SDS-PAGE分析，出现特异性蛋白质条带，并具有生物学活性。结果发现人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达，表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖，为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。

采用基因工程技术，可以表达外源蛋白进行后续研究。美迪西拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术，可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。

3、内皮抑制素蛋白对肿瘤细胞的作用研究

有研究者观察了内皮抑素对人舌鳞癌肿瘤的生长、脉管生成及颈淋巴转移的影响，并对内皮抑素抑制脉管生成可能的机制进行分析[3]。研究者应用Tca83舌鳞癌细胞系建立裸鼠舌癌原位移植模型，将裸鼠随机分为A、B、C共3组，分别给予A组皮下注射生理盐水0.1ml；B组皮下注射内皮抑素10mg/kg/d；C组皮下注射内皮抑素20mg/kg/d。每日注射药物一次，连续给予两周。观察舌癌动物模型肿瘤生长及淋巴转移特点，采用免疫组织化学方法标记病灶中的脉管。并检测VEGF-C的表达情况，计数病灶脉管密度及VEGF-C阳性率。

结果发现肿瘤血管生成在肿瘤生长中发挥重要作用，内皮抑素可以抑制肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤生长，且具有剂量依赖性，随浓度增加其抑制作用逐渐增强，但未见其缩小抑或消除肿瘤的作用。肿瘤淋巴管生成在恶性肿瘤的侵袭转移过程中具有重要作用，高剂量内皮抑素可以抑制肿瘤淋巴管生成，从而抑制肿瘤淋巴转移。内皮抑素可能是通过下调细胞VEGF-C的表达进而抑制肿瘤淋巴管生成。

还有研究者拟采用重组人血管内皮抑素(endostatin)研究内皮抑素对体外培养的神经胶质瘤细胞株增殖作用及VEGF和核仁素表达的影响，进一步为脑神经胶质瘤的临床治疗提供新的途径和理论依据。结果发现在体外内皮抑素可以下调胶质瘤细胞VEGF表达；另外对核仁素表达也有一定程度的影响，推测VEGF和核仁素在内皮抑素抑制胶质瘤细胞的增殖作用过程中起到一定的作用，但是其具体的作用机理目前还不太清楚。

还有报道称，超过32种植入小鼠体内的动物和人的肿瘤通过内皮抑素蛋白的治疗可以被不同程度地抑制。内皮抑素剂量为10~100mg/(kg.d)，肿瘤抑制率为47%~91%，并且均没有毒副作用。

虽然临床上使用内皮抑制素来抑制肿瘤内新生血管的形成来抑制肿瘤的生长和转移，然而这种药物蛋白治疗肿瘤时需要大剂量，而且其分子量大，静脉用药不安全，只能通过肌肉或皮下注射给药。因此长期使用，会影响药物吸收和引起疼痛。目前国内外学术界对内皮抑素的临床疗效也还一直存有很大的争议。有的研究者认为，内皮抑素的作用机制还不明确，临床上无法评估抑制肿瘤血管生产的效果，该药进入临床研究还为之过早。还有研究者对内皮抑素的最大耐受剂量的确定存在疑问，由于血管生成抑制作用比传统的细胞毒素剂要慢很多，内皮抑素只有很少的甚至没有毒性。因此制定出血管生成抑制因子临床疗效的评估体系是比较重要的。

[1]人内皮抑素在毕赤酵母中的组成型表达及其活性检测[J].

[2]人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定[J].

[3] 内皮抑素对裸鼠人舌鳞癌颈淋巴结转移模型的实验研究[J].