肺炎病原学诊断

肺炎病原学诊断
上海市儿童医院 张泓
引起小儿肺炎有多种病原微生物，包括病毒、细菌、支原体、衣原体均可引起肺炎，在众多的病原中，病毒与细菌是引起小儿社区获得性肺炎最常见的病原体。在病毒病原中，最常见的呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒，流感病毒A和B，副流感病毒1、2、3，腺病毒，偏肺病毒和鼻病毒。细菌感染常见于8%一30%的肺炎病例，主要发生在小于2岁以下的婴幼儿，引起小儿社区获得性肺炎的常见细菌包括肺炎链球菌、B型流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌，其中肺炎链球菌是引起小儿肺炎的最常见细菌。其他非典型病原体包括肺炎支原体、肺炎衣原体和沙眼衣原体等。
细菌病原微生物检测方法包括血培养、鼻咽分泌物细菌培养等，免疫荧光法鼻咽分泌物的病毒抗原检测，作为敏感性与特异性更好的检测方法，定量PCR(real-time PCR)在小儿急性呼吸道感染病原学研究与临床中正逐步得到应用。
一、肺炎病原微生物的分离培养
1、血液标本
血培养是一种简单易行的肺部感染病原学诊断方法。由于细菌培养阳性率相对较低，故常被临床忽视。有报道肺炎伴发菌血症机会5％～10％，重症和免疫抑制患者则较高。血标本采集方便、安全，且污染机会少、特异性高，它们在病原学诊断上具有特殊意义。肺炎患者血培养和痰培养分离到相同细菌，该菌可确定为肺部感染的病原菌。如仅血培养阳性，但不能用其他原因如腹腔感染、静脉导管解释菌血症的成因，血液中所分离的细菌亦可认为是肺部感染的病原菌。因此，对重症特别是免疫抑制宿主肺炎，应尽早、多次采血作细菌和真菌培养。为了提高血培养的阳性率必须采用全自动血培养仪配备的儿童专用血培养瓶（包含了需氧菌和厌氧菌的培养），内含抗菌药物吸附剂 (树脂)，有助于提高已接受抗菌药物治疗患者血培养的检出率，血培养标本采集必须在使用抗菌药物之前，每次2瓶，在不同部位采血。采血量，儿童3-5ml，婴幼儿1-2ml。采集后的血培养瓶应立即送往实验室。
2、痰标本
痰标本采集方便、易行，对病原学诊断具有重要价值，但由于咳痰受到口咽部定植菌污染，分离到的细菌往往不能真正代表下呼吸道感染的病原菌。痰培养结果的解释应结合临床表现、痰液直接镜检、细胞学筛选、定量或半定量培养以及所发现的微生物的致病力等，综合考虑。指征：凡有痰液的下呼吸道感染患者均可采集此类标本进行涂片（革兰染色等）和培养检查。可用于普通细菌、分枝杆菌、真菌的检测，但不适于检测厌氧菌。标本采集：必须在使用抗菌药物之前，在无菌条件下，用负压吸引法吸取患儿会咽部以下的下呼吸道的分泌物，置灭菌三通管内，立即床边接种于血平板、选择性巧克力平板及麦康凯平板，同时做痰涂片。一份合格的痰标本应该是痰涂片镜检每低倍镜视野<10个鳞状上皮细胞，>25个中性粒细胞。标本采集后1h内必须立即进行实验室处理，室温下延搁2h会降低肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌的分离率，而定植于上呼吸道的非致病菌以及许多条件致病菌如铜绿假单胞菌等革兰阴性杆菌则过度生长。除部分呼吸道病毒和新生儿沙眼衣原体外，从咽后壁或鼻咽部采集的痰液进行病原学检测常无意义。痰标本也可以用直接免疫荧光法快速检测出下呼吸道的病毒感染。单克隆抗体的直接免疫荧光法可检出该细胞离心标本涂片的7中病毒感染。
3．经支气管镜采样
纤维支气管镜（简称纤支镜）检查可直接从肺部感染灶获取支气管分泌物，操作较为安全。在过去二、三十年中，其应用面得到快速发展，其中之一是用于检测痰标本中难以明确的一些不常见的病原体，尤其在免疫缺陷患者。指征 对于不能咳出或诱导出足够的痰液患者，支气管镜检查可作为获取标本进行分枝杆菌培养的一种方法。目前，支气管镜检查在检测吉氏肺孢子虫、某些机会性致病真菌（不包括念珠菌）、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、军团菌和分枝杆菌等感染时有显著的优点，获得的外周肺组织病灶标本也可用于组织学检查。方法 术前应做肺功能和凝血功能检查。术中患者应保持固定体位，可经鼻或口腔插入支气管镜。选用利多卡因采用喷雾或局部浸润进行局部麻醉。局麻药具有抗菌和抗分枝杆菌的特性，但迄今的研究资料表明，在采集后1～2h内处理标本，局麻药并不影响绝大多数微生物的检测。常用采用方法有经纤支镜吸引、支气管肺泡灌洗、防污染毛刷采样和防污染支气管肺泡灌洗等。
1）检出的微生物不存在解释困难问题，尽管这些标本同样存在被上呼吸道菌群污染。相关微生物包括致病菌和一些机会性致病真菌、寄生虫、病毒、军团菌和分枝杆菌等。通过采集多种标本如经支气管肺活检、支气管灌洗和刷检等，可提高微生物的检出率。送检需氧菌、军团菌、奴卡氏菌、真菌、分枝杆菌和病毒，约需15ml支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage,BAL）。其余的BAL液在低速离心下，可沉淀出细胞成分，细胞经不含镁、钙的无菌缓冲盐水悬浮和洗涤两次后，将细胞沉积物用盐水把浓度调整为2.0 x105/0.2ml，然后在500×g的离心力下于玻片上制成细胞离心标本。BAL标本可以用直接免疫荧光法快速检测出下呼吸道的病毒感染。单克隆抗体的直接免疫荧光法可检出该细胞离心标本涂片的7中病毒感染。
2) 包括送检细菌的所有标本，这些细菌通常是上呼吸道正常菌群的组成部分。对下呼吸道感染的可疑患者，做细胞学筛选和涂片革兰染色。这些标本可与咳痰标本相似的方法进行培养。因为受到上呼吸道菌群的污染，不可以作厌氧菌培养。普通的支气管吸引，即插入纤支镜抵肺炎病灶引流支气管内，依次连接标本采集瓶或试管及负压吸引装置，用负压将下呼吸道分泌物吸入标本采集瓶内送检。此方法虽然简单，但对检出上述病原体不如BAL。BAL除了用于机遇性感染以检测不定植于上呼吸道的病原体如肺炎支原体、军团菌、分枝杆菌、巨细胞病毒、吉氏肺孢子虫以外，多数作者认为BAL对于细菌性肺炎也不失作为病原学诊断的重要采样技术之一。有研究表明定量BAL培养的敏感率和特异性高，检测细胞内病原菌的特异性高达89％～100%。结果的差异是由于研究的人群不同，检测前服用抗生素和采用的参照试验不同而造成的。BAL液经过离心还可作细胞成分分析，若鳞状上皮细胞≤1％可作未受明显污染的“合格”标本。中性粒细胞＞80％，特别是发现细胞内细菌可判断为肺部细菌性感染。研究表明，如果BAL液细胞成分涂片的革兰染色结果阳性，且每个油镜下显示一种或多种微生物，那么该标本培养肯定阳性。定量细菌培养可区分污染菌和病原菌，但划界浓度尚不统一，103～105CFU/ml均有报道。
4．胸水
肺炎患者伴发胸腔积液比较常见，约占10%～50%，但通常液量较少。虽然多数胸水不能发现细菌，但因为胸水系无污染的微生物标本，如出现阳性培养结果，则对临床治疗有着非常重要的指导意义。指征 对大多数伴有胸腔积液的肺炎，无论确诊与否，应该行胸腔穿刺术采集标本。如胸水量大，胸穿又同时是一种治疗手段。对有出血倾向或凝血异常者，禁忌此项操作。对肺功能储备差且不能耐受气胸的患者，除非准备全套支持设备并且基础疾病稳定，否则也不宜进行此检查。方法 患者通常取坐位，上身挺直，用肘靠在一支撑物上，身体稍前倾。对穿刺处皮肤消毒并行局部麻醉后，取一连接50ml无菌注射器的14号标准钢针在存在积液区域的腋后线最低位肋骨的上缘刺入。抽取的液体量不定，一般送检的胸水为10～40ml，而治疗性穿刺则尽可能抽完胸水，但是为了防止出现肺水肿，单次抽液不宜超过1000～1500ml。可余留部分胸水以便日后的胸膜活检。对少量或局限性胸腔积液，或量大但用常规方法很难抽出的胸腔积液，可在超声引导下行穿刺。胸水可封闭在注射器中或注入一厌氧容器并迅速送到微生物实验室检验，同时还应提供相关信息，如操作的日期和时间、需要进行的染色和培养类型。胸腔积液或脓胸均应做厌氧培养。此外，还应做其它检查，包括分类细胞计数和pH测定，腺苷脱氨酶（ADA）测定对鉴别结核胸膜炎具有较好价值。胸水的抗原检测用于疾病诊断，如流感嗜血杆菌b型、肺炎链球菌、军团菌或新型隐球菌。评价 胸水是无污染标本，不论被检测出的微生物数量多少，都被认为是病原体。近年来不少作者建议同时将5～10ml的胸水直接注入血培养瓶内送检，可提高细菌检出率。有时一些来自皮肤的非致病菌，如表皮葡萄球菌、类白喉杆菌、痤疮丙酸杆菌可污染胸水标本，但分离出的量很少。经胸腔留置导管采集的胸水标本，细菌培养也可分离出某些微生物，它们可能只是定植于胸腔引流管，并不引起疾病，应注意鉴别。
二、病原微生物的抗体检测
血清学检查通常用于检测非典型病原体如肺炎支原体（MP）、肺炎衣原体（CP）、军团菌。常用方法有间接免疫荧光试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫法（RIA）、颗粒凝集试验（PA）等。MP-Igm检测有ELISA和 PA等。近年多用PA测定MP-Igm杭体，确诊MP急性感染则应强调双份血清(间隔2周)恢复期抗体滴度上升4倍或下降至原来的1/4或抗体滴度持续>1:160。支原体培养阳性率依然较低，目前临床上多依赖MP抗体检测，而对MP急性感染诊断当属MP-IgM测定。MP-IgA抗体，其出现较稍晚，但持续时间长，特异性强。检测MP-A够可供回顾性诊断，是病原学追踪的较好手段，但无早期诊断价值。MP易感人群的误区4一20岁是MP最易感。
肺炎衣原体（Cp）培养的要求较高、技术也较复杂、操作繁琐，培养花费时间长、培养结果受标本质量的影响等因素制约，不适宜作为临床诊断技术，也不能用于大样本的流行病学调查，但由于细胞培养特异性是10%，因此目前主要用于作科研及评价其他诊断的参照手段。血清学检刻血清学检测是目前诊断Cp感染的主要手段。血清学诊断方法主要包括:微量免疫荧光法(MIF)、酶联免疫吸附实验(ELISA)。MIF为一种间接免疫荧光试验法，MIF抗体包括3种:IgM,IgG和IgA。初次感染(原发感染)时，IgM于发病后3周出现，IgG于发病后6一8周出现，而IgA反应较弱或不出现;再次感染(重复感染)时，IgG常在1一2周内出现，且效价可以很高，但往往没有IgM出现或其效价很低。诊断标准:急性感染时，双份血清抗体效价升高4倍以上，或IgM,≥1:16, Ig G≥1:512;既往感染时，IgM≤1:16，IgG≤1:512。为排除血循环中的类风湿因子可能对MIF检测结果的影响，在测定IgM前应常规进行吸附实验。

三、PCR方法在病原微生物诊断中的应用
近年来，随着现代生物技术的快速发展，建立在分子生物学基础上的快速检测病原微生物技术得到了迅速的发展。使得疾病诊断的水平有了很大的提高。这些基于核酸的方法具有快速、敏感等优点。PCR是近20年才发展起来的技术，其应用已趋于多元化，从基因扩增与基因检测，到基因克隆、基因改造、遗传分析等，甚至扩展到非生物学领域。同时，PCR技术的本身也获得长足进步，可靠性不断提高。PCR可以直接从临床标本中快速、准确地检测出包括苛养菌在内的细菌，还被用来检测耐药基因。已经有很多种PCR方法用于检测病原微生物，如随机扩增DNA多态性分析、限制性片段长度多态性分析PCR和多重PCR。多重PCR既保留了常规PCR的特异性、敏感性，又减少操作步骤及试剂，实现了一次扩增同时检测多种微生物的目的。2007年，土耳其学者刮用传统方法和PCR方法直接检测75例样本(53例脑脊液、22例中耳渗液)中的流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌，标准PCR用于检测流感嗜血杆菌，多重PCR检测肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌，结果相对于传统方法，PCR检测的敏感性和特异性分别为100％和87.3％，阳性预期值是30.8％，阴性预期值是100％。显示PCR方法在检测腩脊液和中耳渗液中的上述细菌时是一种快速、可靠、可行的方法。2008年，智利学者用多重PCR检测了99例脑脊液样本中易引起儿童细菌性脑膜炎的常见致病菌：肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌、流感嗜血杆菌，其中90例是培养阴性的样本，9例是培养阳性的样本，结果显示，多重PCR检测上述细菌的敏感性为89％，特异性为100％，阳性预期值是100％，阴性预期值是99％，与传统方法的结果一致率为89％。
实时定量PCR实时PCR是指在PCR指数扩增期间，通过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量，并据此推断目标基因的初始量。该方法所具有的简便、特异、敏感和快速的特点使其在实验室中的应用正迅速扩展，实时定量PCR同时进行扩增和荧光检测的步骤，整个过程都在一个密闭仓中进行，所以减少了污染可能性，而且检测过程可以在1h以内完成。实时定量PCR相对于免疫测定、培养鉴定等传统方法的优势主要在于更高的敏感性，更短的耗时以及更广的适用范围。

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