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碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌（CRE）已经成为医院一些科室十分棘手的问题，如ICU、呼吸科、血液科和老年科等。病人一旦感染CRE不但花费惊人而且死亡率大大增加，给患者健康带来了巨大危害。而如何快速的检测CRE对临床预防和治疗意义重大。本文总结了不同碳青霉烯酶的全球分布情况，同时重点概括和比较了不同CRE检测方法和治疗策略的优势和局限性，介绍了一些新型抗菌药物治疗CRE的前景。本文主要讲述了产碳青霉烯酶CRE的相关检测与治疗方法，值得一读。
碳青霉烯类抗生素通常被认为是治疗多重耐药菌感染最有效的抗菌药物。然而，随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，CRE患病率迅速增加，并对公共卫生构成严重威胁。
全世界CRE耐碳青霉烯的主要机制是产生碳青霉烯酶。碳青霉烯酶是能够水解碳青霉烯类抗生素β-内酰胺酶。根据Ambler分类方法，碳青霉烯酶可分为A、B和D类。A类和D类酶为丝氨酸酶，B类碳青霉烯酶是金属酶（MBLs）。CRE和产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌（CPE）有大部分重叠，但二者命名方式不同：CRE以耐碳青霉烯的表型命名，CPE以耐药机制（产碳青霉烯酶）命名。正确区分CRE和CPE并快速检测CPE对临床感染的治疗和管理非常重要。本文总结了CRE的流行病学，CPE的检测，以及临床治疗的现状。CRE的广泛分布与其产生碳青霉烯酶和质粒介导的编码基因的水平传播密切相关。CRE的流行特点以及碳青霉烯酶种类与地理区域高度相关。
2001年，美国首次报道了一种携带质粒介导的碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌（KPN）菌株，该基因编码的蛋白质后来被命名为肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）。此后，blaKPC在美国、南美和欧洲一些区域相继报道产KPC的CRE菌株广泛传播。在中国，2007年首次发现产KPC的CRE菌株。KPN是临床上产生KPC的主要CRE。中国的主要序列类型（ST）为ST11，美国为ST258，其他国家为ST340、ST437和ST512。因此，克隆传播是产生KPC的KPN传播的主要机制。
2009年，印度首次报道与blaNDM相关耐碳青霉烯的KPN。NDM型β-内酰胺酶主要分布在亚洲，尤其是中国。由于广泛宿主范围质粒的传播，blaNDM相关大肠杆菌的高多样性被检测，其中ST131、ST167和ST410是主要序列类型。此外，自IMP-1在冈崎首次发现，blaIMP在日本广泛分布。目前，产IMP的肠杆菌科细菌的高发地区包括日本和中国台湾，其他国家散发。希腊是产VIM肠杆菌科细菌的中心。欧洲其他地区以及一些亚洲地区也有暴发。此外，全球均有产VIM肠杆菌科细菌散发的相关报道。 D类β-内酰胺酶又被称为苯唑西林酶（OXA）。1985年，英国首次发现鲍曼不动杆菌中存在OXA编码基因，并命名为blaOXA-23。此后，肠杆菌科陆续发现其他OXA家族成员，包括OXA-23型、OXA-48型、OXA-40型、OXA-51型和OXA-58型。最常见的D类β-内酰胺酶是OXA-48。OXA-48包括经典的OXA-48及其变体OXA-181和OXA-23。产OXA-48的CRE主要集中在欧洲国家、中东和地中海国家，包括北非。在过去几年中，已有关于同一肠杆菌科存在多种碳青霉烯酶的报道。例如，blaNDM-1和blaIMP-4在KPN中共存，阴沟肠杆菌或弗氏柠檬酸杆菌同时表达blaKPC和blaNDM。此外，产酸克雷伯菌同时表达KPC-2、NDM-1和IMP-4三种碳青霉烯酶，而含有这三种耐药基因的质粒在肠杆菌科的大多数其他成员中出现，包括大肠杆菌、阴沟肠杆菌和克雷伯菌属。最初的药敏试验，如溴稀释技术、柯比-鲍尔圆盘扩散法和和自动分析系统是简单的标准化方法。但使用CLSI或EUCAST指南推荐的筛选折点以及自动化系统检测存在一些不足之处。因此，表型检测和基于分子的技术是目前用于检测碳青霉烯酶的两种主要方法。改良霍奇试验（MHT）是CPE常用的表型检测方法。该方法在检测产KPC的CRE方面具有较高的灵敏度和特异性，但在检测B类β-内酰胺酶时灵敏度较低（<50%）。较低灵敏度可通过添加Triton X-100提高，可提高灵敏度至90%以上，且可同时增加其他碳青霉烯酶菌株的检测率。但可能会同时出现假阳性和假阴性。Nordmann等随后提出比色法，即Carba NP试验，其检测迅速且假阳性率低。而后Pires等提出Blue-Carba试验，可将灵敏度从93.3%提高到100%。Bogaerts等提出Bogaerts-Yunus-Glupczynski（BYG）Carba检测，可将检测时间缩短至30分钟，并对产碳青霉烯酶分离株进行实时客观测量。也可通过各种商业化产品检测碳青霉烯酶，如Rapidec Carba NP、Rosco Rapid Carb Screen和Rapid Carb Blue Kit，但大多数快速比色法对OXA-48型的敏感度较低。2018年出现的基于碳酸氢盐的MBT STAR-Carba试剂盒（Bruker Daltonics）在检测OXA灵敏度更高，但仍不能避免未知错误。碳青霉烯灭活法（CIM）是另一种有效的表型检测试验。该结果与碳青霉烯酶基因高度一致，包括用聚合酶链反应（PCR）检测到的编码KPC、NDM、VIM、IMP、OXA48和OXA-23基因（在肠杆菌科100%一致）。2017年CLSI推荐使用改良CIM（mCIM）。mCIM的敏感性和特异性均为100%。目前mCIM已成为微生物实验室的有用工具。分光光度法为检测CPE可靠检测方法之一。但该试验耗时，且受其他因素影响。为克服局限性，Takeuchi等提出双波长测量法。该试验可节省时间，且灵敏度和特异性高，结果与mCIM一致。然而，对特定仪器（分光光度计）的要求和小样本量限制其在临床的应用。2011年，Hrabák等提出基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）筛选CPE。2015年，Papagiannitsis等在反应缓冲器中加入NH4HCO3，将灵敏度从76%提高到98%。Lasserre等可在30分钟内直接检测初级培养板中的耐药肠杆菌并确保高灵敏度和特异性。厄他培南水解测定法可快速准确地检测出血培养阳性的肠杆菌科菌株的碳青霉烯酶活性。虽然使用MALDI-TOF MS的测量成本低，但昂贵的设备限制了其在临床上的广泛应用。除此之外，将硼酸与厄他培南或美罗培南盘相结合已被用于检测KPC产生。将乙二胺四乙酸添加到碳青霉烯盘可用于检测MBLs。使用单克隆抗体可直接快速检测OXA-48类碳青霉烯酶。一种基于生物发光的碳青霉烯类药物敏感性的检测方法，可区分产生碳青霉烯的CRE和不产生碳青霉烯的CRE，其灵敏度为99%，特异性为98%。基于分子技术的测试是检测碳青霉烯酶基因的金标准，其优点和局限性见表1。PCR是最常用的传统检测分子基因型的方法。然而，PCR检测单一基因很耗时。多重实时PCR可快速检测大多数碳青霉烯酶，如KPC、OXA-48、VIM、IMP和NDM。此外，又出现多种改良方法如基于高分辨率熔体分析的实时PCR检测，以及使用多肽核酸探针的多重PCR检测。表1：常规检测方法的优缺点
除上述方法外，Walker等结合嵌套PCR、实时PCR和微流控技术来识别常见碳青霉烯酶基因。一种基于PCR的盒式方法可用于检测直肠拭子中的CPE。该方法在短时间（32-48分钟）即显示出高灵敏度（96.6%）和高特异性（98.6%）。Srisrattakarn等提出一种循环介导的等温扩增方法，敏感性和特异性均为100%。2018年，可微流控芯片技术被用于检测碳青霉烯类耐药基因，其灵敏度和特异性都很高（均>90.0%），完全满足临床诊断要求。基于微阵列的商业化产品Verigene革兰阴性血培养测定可用于鉴定碳青霉烯酶，但材料成本贵。全基因组测序是检测碳青霉烯酶基因最可靠的方法，但成本高、周转时间长、数据管理困难等问题限制了其在临床应用。Yu等还提出一种新型多重PCR扩增反应，可直接快速鉴定流行的CRKP ST258/ST11菌株。常用检测方法的优势和局限性见于表1。几乎所有β-内酰胺类抗生素对CRE感染治疗效果有限。某些限制使用级药物，如多黏菌素、替加环素和磷霉素可能具有活性。相当比例产KPC和OXA-48的CRE菌株也对氨基糖苷类药物（庆大霉素和阿米卡星）敏感。然而，单一抗生素治疗CRE感染效果不好。多黏菌素具有肾毒性和神经毒性，治疗最佳剂量不明。多黏菌素受到黏菌素耐药基因（mcr）影响。在肠杆菌科分离株中同时存在mcr-1和blaNDM。FDA已明确提出替加环素可引起死亡率增加。替加环素首次用于临床后就有耐药相关报道。耐药机制包括tet突变和RND外排泵表达增加。氨基糖苷类药物对CRE感染治疗受到rmtB影响，rmtB可引起广泛耐药。磷霉素治疗效果也有限，可快速出现耐药，这一耐药与磷霉素诱导的基因密切相关。携带fosA3的大肠杆菌菌株对碳青霉烯、多黏菌素和替加环素耐药。
为增加抗生素疗效，可使用多黏菌素雾化吸入、更大的多黏菌素和替加环素维持剂量。目前多推荐采用联合疗法治疗耐多药CRE感染。动物实验和临床试验均证明联合疗法可有效治疗CRE，并降低死亡率。联合疗法的方案见表2。然而，大多数常用的联合疗法及其协同作用的机制基础尚不明确。表2：联合疗法的优缺点
除了抗生素联合治疗外，新型β-内酰胺酶抑制剂被用于治疗CRE感染。阿维巴坦（AVI）可抑制KPC、ESBL、AmpC和OXA-48。头孢他啶-AVI（CAZ-AVI）同时对产KPC和OXA-48的菌株和携带blaKPC-2的高毒力KPN有效。CAZ-AVI治疗复杂尿路或腹腔内感染效果较好。与多黏菌素相比，CAZ-AVI在治疗产KPC的CRE疗效更好、死亡率更低和副作用更少。然而，自2015年以来，关于耐CAZ-AVI的分离菌株已有报道。氨曲南-AVI能有效地抑制A、B和D类碳青霉烯酶。另有亚胺培南-瑞来巴坦和美罗培南-法硼巴坦也被用于治疗CPE感染。后者已被FDA推荐。这两种组合均对产KPC的肠杆菌科细菌有很高的活性，但对MBLs和OXA型碳青霉烯酶的敏感性较差。此外，处于临床试验阶段中的美罗培南-nacubactam对KPC和产MBL的CRE也有良好体外活性。头孢吡肟-齐达巴坦可抑制产生A、B和D类碳青霉烯酶的CRE，其他早期研发的头孢吡肟-β-内酰胺增强剂，如头孢吡肟-恩美拉唑巴坦（AAI101）/WCK-5153等意味着不含碳青霉烯新方案的出现。治疗CRE感染的其他新药，如Plazomicin、依拉环素和cederocol正处于不同的研发阶段。其中Plazomicin比其他氨基糖苷类药物效能更强和副作用更少；依拉环素也有良好临床效果。关于cederocol的临床应用尚需更多临床证据。2018年，FDA推荐普拉唑霉素和依拉环素注射制剂，但之后仍出现耐药现象。新型抗菌治疗药物的优势、局限性和耐药性机制见表3。表3：新型抗菌治疗的优缺点
除了新型药物外，尚有针对碳青霉烯类药物耐药的其他方法。例如粪便微生物群移植（FMT）和肠道病原体的研究，FMT有清除患者体内CRE定植的可能，但可行性需进一步研究。一种用于精确清除基因组岛的新型合成工具有望取代抗生素治疗。关于以单克隆抗体和阳离子抗菌肽等免疫疗法替代传统抗生素以及应用捕食性细菌的可行性正在研究中。新策略的优点和局限性见表4。表4 ：新型方法的优缺点
近几十年来，CRE在全球各医疗机构广泛传播，因其检测方法耗时和治疗方法的局限性，患者的死亡率很高。因此，及时准确地检测CRE，尤其是CPE，对于临床治疗和预防感染至关重要。目前有多种表型方法和基于基因的方法可用于碳青霉烯酶的快速检测，这些方法有望在临床微生物学实验室中得到常规应用。目前，已经推荐或正在研发的新型抗菌药物和新兴策略，具有良好的效能和安全性，有望在不久的将来应用于临床。
空军军医大学（第四军医大学）西京医院重症医学科主任中央保健会诊专家、长江学者特聘教授、享受国务院政府特殊津贴
[1] Cui X, Zhang H, Du H. Carbapenemases in Enterobacteriaceae: detection and antimicrobial therapy[J]. Frontiers in microbiology, 2019, 10: 1823.
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