大蒜素联合伏立康唑对念珠菌的体外抗菌活性研究

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念珠菌是住院患者中侵袭性真菌感染最主要的病原菌，为成年人重症监护室(intensive care unit，ICU)中血流感染和导管相关性尿路感染最常见的病原，并呈增长趋势，在我国居血流感染病原菌的第四位，并呈现快速增长[1-2]。真菌的耐药率及死亡率的逐渐增加，严重威胁患者的生命健康[3-4]。在抗真菌药物的使用过程中，伏立康唑是目前临床用于治疗一线真菌感染的首选药物，并取得良好的治疗效果[5]。但由于其价格昂贵、不良反应大等问题成为临床上治疗念珠菌感染棘手的问题[6]。大蒜素是从大蒜中提取的含硫有机化合物，其主要的有效成分为二烯丙基三硫化物，近年来国内外研究表明，其具有抗炎、抗菌及抗氧化等作用，且生物性能好、毒副作用小、已被广泛应用于临床抗感染治疗[7]。目前，为寻找更好的抗真菌疗法，联合应用不同药理作用机制的抗真菌药物，减少其不良反应及耐药问题的研究正在展开。本研究旨在评价伏立康唑和大蒜素联合抗念珠菌的体外活性，以期为临床治疗念珠菌感染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究材料

收集于2016-2019年航空总医院临床微生物室送检的79株念珠菌临床标本，包括白色念珠菌(Candida albicans)58株、光滑念珠菌(Candida glabratas)10株、热带念珠菌(Candida tropicalis)6株以及近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)5株。以白色念珠菌标准菌株ATCC90029为质量控制菌株。

1.2 抗菌药物

大蒜素(Garlicin)，规格为20 mg，北京索莱宝科技有限公司；伏立康唑(voriconazole)，规格为1 g，北京索莱宝科技有限公司。

1.3 仪器与试剂

采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪(法国生物梅里埃公司)；酵母样真菌鉴定卡、酵母样真菌药敏卡(微量稀释法；法国生物梅里埃BioMerieux公司)；酶标仪：Sunrise(瑞士Tecan公司)；沙保罗琼脂培养粉(杭州滨和有限公司)；RPMI1640培养基购自美国赛默飞世尔仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 菌液配置

从-80℃冰箱取出待测菌，室温下融化，接种于沙堡罗琼脂培养基35℃下孵育24 h；取单一的菌落再转接种于沙保罗琼脂培养基35℃孵育24 h，以确保菌种的活力，挑菌落置于3 ml 0.85％的生理盐水中，用牛鲍氏计数盘计真菌数量，再用RPMI-1640培养基稀释，终浓度约为2.0×103 CFU/ml。

1.4.2 药液配置

实验时用100%二甲基亚砜(DMSO)将伏立康唑溶解制成640μg/ml，配制过程中应剧烈振荡，直至完全溶解为止，将无菌贮存液分装至无菌的聚丙烯小管内，存于-80℃冰箱，用时取出。用RPMI1640培养基倍比稀释，初浓度为64μg/ml，终浓度为0.06μg/ml。用RPMI1640培养液将大蒜素配制成1024μg/ml的原液，用RPMI1640培养液倍比稀释使大蒜素终浓度为128μg/ml。

1.4.3 单药最低抑菌浓度测定

最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)的操作方法按照美国临床实验室标准化研究所协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的微量稀释法。伏立康唑：0.06～64μg/ml；大蒜素：4～128μg/ml，每孔加100μl于96孔板中，再加入100μl含菌培养液，阳性对照为100μl含菌培养液培养和100μl无药培养液，阴性对照孔为不含菌不含药的培养液。置于35℃恒温培养48h，实验重复3次。酶标仪检测96孔板吸光度值(OD值)，最低抑菌浓度(MIC50)为与阳性对照相比吸光度值下降50％，最低抑菌浓度(MIC90)为与阳性对照相比吸光度值下降90％。

1.4.4 棋盘法联合药物体外抗真菌作用

采用棋盘微量稀释法实验，用倍比稀释的伏立康唑50μl加入96孔板的A～H行中，用倍比稀释的大蒜素50μl加入96孔板的1～8列中。药物的浓度：大蒜素为4～128μg/ml，伏立康唑为0.06～64μg/ml。于每孔中加入100μl菌液，阳性对照为100μl含菌培养液和100μl无药培养液，阴性对照孔为不含菌不含药的培养液。置于35℃恒温培养48h，实验重复3次。

1.4.5 抗菌后效应

实验设检测管T管和对照管C管，T管用大蒜素加伏立康唑原液作用念珠菌2h(菌液终浓度为1×106 CFU/ml，药液浓度为10倍于MIC的浓度)，C管无药液的对照，同步35℃培养2 h。T管、C管离心除去药物后，加入RPMI1640培养液，恢复至初始体积，此时记为观察的零点。T管和C管同步置于35℃培养8h。

1.5 判断标准

采用分级抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)法判定药物联合作用效果，其FICI法计算为公式1：

∑FICI=FICA+FICB=MICA联用÷MICA单用+MICB联用÷MICB单用(1)

FICI≤0.5协同作用，0.5～1相加作用，1～2无关作用，＞2拮抗作用[8]。

2 结果

在79株念珠菌中，包括伏立康唑敏感的69株和耐药的10株，耐药菌株包括7株光滑假丝酵母、3株热带假丝酵母。对伏立康唑敏感的69株念珠菌对5-氟胞嘧啶、伊曲康唑、两性霉素B和氟康唑均敏感，对伏立康唑耐药的10株念珠菌对真菌药敏试剂盒的其他4种药物均耐药。

2.1单药联合用药MIC变化

联合用药较单一用药的MIC50和MIC90均有明显降低。联合用药对伏立康唑敏感的念珠菌MIC50伏立康唑降低2倍、大蒜素降低8倍(分别为由0.06μg/ml降至0.03μg/ml、16μg/ml降至2μg/ml)，对伏立康唑耐药的念珠菌MIC50伏立康唑降低2倍、大蒜素降低8倍(分别为由32μg/ml降至4μg/ml、4μg/ml降至0.5μg/ml)，大蒜素与伏立康唑单用和联合应用对敏感和耐药的念珠菌的MIC比较见表1。

2.2 FICI值

在79株菌株中，FICI≤0.5为100%，表现为协同作用。

2.3

抗菌后效应大蒜素与伏立康唑联合应用对敏感念珠菌的抗菌后效应(post antibiotic effect，PAE)为1.31 h；大蒜素与伏立康唑联合应用对耐药念珠菌的PAE为1.7 h，见图1。

3 讨论

念珠菌的种类很多，常见的有白色念珠菌、光滑念珠菌，热带念珠菌等，在侵袭性真菌感染中，白色念珠菌感染占首位，其次是光滑、近平滑念珠菌[9]。中药作为祖国传统用药有着悠久的历史，在治疗疾病方面具有天然的优势，其取材方便和不良反应小。大蒜素对多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、寄生虫和病毒均有良好的抑制作用[10]。大蒜素在临床抗感染治疗中取得较好的效果，而联合用药能显著提高单药的抗菌作用，大蒜素联合制霉菌素治疗鹅口疮能显著提高有效率，降低复发率[11]；联合抗菌药物治疗细菌感染呼吸机有关的肺炎时能显著降低抗生素使用时间及ICU的住院时间，从而降低不良反应的产生[12]。Khodavandi等[13]报道，大蒜素与唑类药物联用有协同作用。

本实验研究选取了临床标本分离的白色念珠菌、光滑念珠菌等常见的念珠菌，以棋盘式微量稀释法初步确定了大蒜素抗念珠菌和大蒜素与伏立康唑联合应用的抗念珠菌的作用效果，结果显示大蒜素与伏立康唑联合应用时，MIC50及MIC90均降低，尤其是对耐伏立康唑的菌株，可以极大减少伏立康唑的用量，从而确定大蒜素可增强伏立康唑的抗菌活性，且具有协同作用。

4 结论

联合应用大蒜素和伏立康唑后对敏感菌株的PAE为1.3 h，对耐药菌株的PAE为1.7 h，为大蒜素与伏立康唑的联合应用提供药理学参数，可以根据药理学参数适当延长给药时间，减少用药的总量。

参考文献