蛋白质分离纯化技术之双水相萃取技术

双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术，是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的，目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时，具有操作简单、体系含水量高，在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。

1、        双水相萃取技术可分离和纯化蛋白

双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化，包含在一些蛋白分离公司提供的服务。早期，如在20世纪60年代，有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究，得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。双水相系统具有温和的操作条件，对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。

双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是：聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。当待分离物质进入体系后，由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的分配系数不同，通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配，从而实现目标组分的分离纯化。

双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点：（1）易于放大，各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1]；（2）双水相系统传质和平衡过程速度快，回收效率高、能耗较小；（3）易于进行连续化操作、设备简单，且可以直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；（4）相分离条件温和，双水相体系的张力很小，有利于保持生物分子的活性，可以直接用在发酵液中；（5）影响双水相体系的因素比较复杂，可调参数多，便于改变操作条件提高纯化效果。美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务，可以根据客户要求，提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。

2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究

α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶，在粮食、食品加工，以及医药行业等都经常使用，由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，周内外很多课题组对它进行了研究。如研究者采用聚乙二醇(PEG)/硫酸铵双水相体系，对双水相萃取法分离纯化α-淀粉酶进行了研究，探讨了PEG分子量、PEG浓度和(NH4)2SO4浓度对α-淀粉酶的分配系数、酶活回收率和相体积比的影响[2]。实验表明，由PEG40021%～22%(W/W)和(NH4)2SO414%～17%(W/W)所组成的双水相体系，在室温下对α-淀粉酶的酶活回收率可达94.84%，分配系数可达17.10。

ε-聚赖氨酸是一种由白色链霉菌发酵生产的含有25～35个L－赖氨酸残基的同型单体聚合物，对革兰氏阳性和阴性菌、酵母菌、霉菌、病毒等都有明显的抑制作用，广泛用于食品、日化、医药产品。该产品可以完全被人体消化吸收，分解成为人体必需的赖氨酸，无任何毒副作用。还有研究者以双水相萃取新技术提取ε-聚赖氨酸ε-PL)作了较深入的探索研究[3]。通过对多个双水相体系的筛选，确定了利用乙醇/硫酸铵双水相体系来萃取ε-PL的方案，得到的最佳萃取条件为:pH 9.5，乙醇/硫酸铵质量分数组成为20%/20%，分配系数和收率分别可以达到18.33和98.02%。进一步探究了多级萃取方式对ε-PL萃取效果的影响，发现3次萃取的效果最好，蛋白质和色素去除率分别达到85.66%和60.00%，ε-PL收率为96.15%。最后，收集经过3次萃取后的上相，利用超滤膜进行简单脱盐浓缩，产品的收率和纯度分别可以达到68.28%和92.39%。

还有研究者建立了由乙醇和（NH4）2SO4形成的双水相体系萃取灯盏花中灯盏花乙素[4]。研究者采用HPLC法对灯盏花乙素含量进行测定，并对影响双水相体系的成相和灯盏花乙素萃取率的条件进行优化。研究发现灯盏花粗提液经过双水相体系萃取之后，能有效减低大分子物质和极性分子的干扰。乙醇体积为1.5 mL、（NH4）2SO4质量分数为25%、pH为6.0时，双水相体系对灯盏花乙素的萃取率达到94.2%。结果发现对灯盏花样品进行的检测和加标回收实验表明，该方法准确性较高、结果可靠、操作简单和绿色无污染。

总之，双水相萃取技术在分离和纯化物质上的作用较大，有着广阔的应用前景。然而其还存在价格昂贵以及体系本身易乳化使得萃取过程极不稳定等缺点，使得开发廉价双水相体系及后续层析纯化工艺，降低原料成本等成为今后双水相分离技术的主要发展方向。

[1] 双水相萃取技术在生物制药中的应用[J].

[2] 双水相萃取法分离纯化α-淀粉酶的研究[J].

[3] 采用双水相萃取技术提取ε-聚赖氨酸[J].

[4] 双水相萃取法测定灯盏花及提取物中灯盏花乙素含量[J].