免疫组化染色是一种利用抗原抗体特异性结合的原理，对组织或细胞内的抗原物质进行定性和定位的染色技术，该染色技术具有敏感性高、特异性强、操作简单等特点，使得其在基础医学研究中发挥着重要的作用，因此也有不少医药研发外包服务公司例如美迪西，提供免疫组化染色服务。 随着神经科学的不断发展和深入研究，脑组织石蜡切片免疫组化成为神经学研究的主要方法之一，但是由于脑组织石蜡切片的免疫组化染色结果，容易出现切片染色不清，脱片、假阳性、假阴性结果，因此需要把控免疫组化的过程的细节及各个步骤的主要的注意事项，提高脑组织切片的免疫组化染色操作技术。免疫组化技术在大鼠脑组织切片研究上的应用如下： 用4%的多聚甲醛固定，固定之前要保持脑组织的平整和完整，不能被挤压，以免影响细胞的形态，影响电镜下观察。 2、脑组织防脱片的处理 传统的防脱片的处理方法有延长烤片的时间、提高烤片的温度和重新脱水。免疫组化前，切片在58-60℃的恒温箱中烤2-24 h，在脱蜡和脱水过程中，把切片稍晾干后再行下一步的免疫组化过程。但不能进行高温烤片，在干燥的条件下加热切片可以加速组织中抗原的氧化而破坏组织中的抗原。 玻片进行化学试剂处理玻片为充分洗净干燥的磨砂防脱载玻片。可以选用免疫组织化学染色中常用防脱片剂即多聚-L-赖氨酸(Poly-LLysine)对载玻片进行处理，处理后载玻片不易脱片。 3、抗原修复 少数抗体可以选择酶消化法.如原位末端标记法（TUNEL）试剂盒中以蛋白酶K为消化酶，在这过程中，注意蛋白酶K的浓度不能过高，过程中不能超过10 min，以免修复太过出现假阴性，且BPS洗涤要彻底。
热修复注意事项： 高压加柠檬酸盐(pH6.0)缓冲液修复，时间为5分钟，冷却后连续修复2次。水浴锅修复时水温为95℃，修复时间为15～60 min。须等缓冲液冷却至室温,才能把切片取出，取切片时防烫伤。 4、内源性过氧化物酶活性的灭活 3%H2O2孵育时间一般8～10 min，时间过长易造成结果假阴性的出现。用BPS充分冲洗三次每次3 min，注意保证BPS的PH值在7.2～7.6。 5、滴加抗体和孵育时间 试剂储存时间过长会影响抗体的有效价,所以试验前检查试剂是否在有效期内,并及时调整储存。一般抗体储存在-20℃的冰箱内，一抗是即配即用，根据说明书上一抗的浓度比例做预示实验，一般是1:50,1:100,1:150，1:200进行对比，然后按最佳效果的比例进行正式试验。 滴加一抗二抗时,须用滤纸将切片周围和多余的BPS液体拭净,以防残留液体稀释工作液,出现不必要的假阴性。为了避免试验的误差，降低试剂的耗损，先离心积液再取用抗体，移液需精准。滴加抗体时须悬空滴加，不能触到脑组织，以免造成脑组织损伤。工作液须完全覆盖住脑组织，如若液体分布不均匀，可轻微晃动玻片或用移液枪头的外侧面但不接触脑组织撑开液面。 不同的试剂的抗体孵育时间不同。在37℃恒温箱中孵育时，一抗的孵育的时间一般是2.5h，二抗为30min，二抗的时间随一抗的延长而延长。湿盒孵育可以在4℃冰箱过夜,孵育出的切片阳性率高。 6、设置阳性对照片和阴性对照片 阴性对照和阳性对照需同时进行，但阴性对照组须与阳性对照组在操作上，所有步骤都应独立，独自漂洗，独自孵育，防止受抗体污染而出现阳性结果。 7、显色试剂配制和时间 DAB显色剂应现用现配,注意颜色是否正常，新鲜配制的显色液为淡棕色，颜色过深，则不用。显色不宜超过10min,一般是2-3min，否则易出现背景深染，或先在低倍镜下观察显色的程度，控制显色的程度，染色充分后立即终止。 8、复染注意事项 注意苏木素配置的时间，是长期还是短期的，观察其色泽，气味，注意苏木素配置的方法不同，其效用也不同，不全是存储越久，染色的质量越好。 苏木素复染需2min,复染只需苏木素浅淡的染色,若过深的苏木素染色有可能覆盖已有的阳性染色。500ml苏木素染液染800-1000张玻片后需更新换液，保证染色质量。每次染色之前应将染液通过滤纸过滤，保持染液干净，防苏木素中的过氧化物沉淀在玻片上影响美观。 封片时宜湿封，防切片细胞龟裂，收缩或黑色结晶样小点，滴树胶不能过稠或稀，稠了会使树胶外溢，易粘在切片上影响美观，稀了封片产生气泡，这些均不利于镜下观察。 免疫组化的过程，看上是一个简单的过程，在这个过程中，每一个过程都是都是很重要的步骤，一步不慎，皆会影响到实验的结果。因此需要操作者每一步都要做到细致规范，熟练免疫组化的每一个步骤，每一个过程中的不同的方法及效果，通过反复的比较对照掌握免疫组化的过程中的方法和时间的把握，且按上面步骤注意操作后，能做出背景清晰，不脱片，易于镜下观察的脑组织切片。 | 
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