细菌内毒素研究概况

细菌内毒素研究概况
2014-02-18 09:45 来源：丁香园  
一、细菌内毒素的研究历史

     细菌内毒素的研究已有200多年的历史，最早的相关研究起始于对腐烂动物的研究。Dane Peter L.Panum是第一位系统地、科学地研究这种毒素的科学家。在1874年，他发表论文明确指出：①这种腐烂毒素是不挥发的，也不是活的微生物，但可能来源于微生物；②毒素耐热，不是一种酶；③注射12mg浓缩物就足够引起高热，致犬死亡。根据我们现在对内毒素的认识，Panum的研究结果以及涉及到内毒素。

由于这种毒素最主要的表现就是引起发热，在19世纪，大多数人称其为致热物质（pyrogenic material）或致热原（pyrogen）。Sir John Burdon-Sanderson（英国生理和病理学家）在1896年，进一步将“致热物质”称为“致热原”，并在前人研究的基础上，获得了部分纯化的致热原，首次提出了致热物质的来源问题：即内源性（致热原存在于血液或组织液内）和外源性（来自微生物）两方面。

随着感染感染性疾病是由微生物所致的认识日益明确，致热原的来源研究也由腐烂组织转移到微生物。丹麦医生Hans-Christian于1884年发明了一种至今被广泛采用的染色技术，即革兰染色法。利用该方法可将所有的细菌分为两类：革兰阳性菌和革兰阴性菌。

内毒素的发现主要归功于对霍乱弧菌的研究，在19世纪后期，经常发生霍乱流行，尤其是1892年前后，在全世界一些大的海港城市发生了大规模霍乱流行，成千上万的人因此死亡。1884年，Rober Koch证明霍乱弧菌为霍乱的致病菌，并在他的实验室开展其致病性研究。经该实验室研究，从霍乱弧菌观察到一种毒素，可牢固结合在细菌细胞上，具有很强的毒性作用，在细菌溶解时才释放出来。由于这种毒素与已经发现的其他毒素明显不同，因此将其称为内毒素（endotoxin）。与此同时，意大利人 Eugenio Centanni从大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌等自溶物种分离出一种无菌白色粉末的高致热原性物质。该物质对热十分稳定，不属于蛋白质，且与细菌的生存和感染引起的病理变化密切相关，被他称为Pyrotoxina，他是第一个认识细菌致热原与内毒素密切关系的人。

20世纪40年代后期，Otto Westphal 和Otto Luderitz 系统地分析了从沙门菌、大肠杆菌和其他肠道杆菌的分离物，进一步发现分离物的致热活性主要集中在O-抗原复合物中，且未降解多糖呈高致热原性，结合蛋白的多糖活性较低，降解多糖和单纯蛋白质则完全无活性。1952年，Westphal 建立了一种更有效的分离方法——热-酚-水抽提法，其分离物几乎不含蛋白质，仅含糖、磷和脂肪酸成分，具有非常强的生物活性，静脉内注射1ng/kg，就可致人发热，被称为脂多糖。该提取方法的建立，被认为是内毒素研究历史上的里程碑，成为经典的分离法而被广泛应用。

随着内毒素分离方法的不断改进和提高，以及相关学科，如化学、生物学、血清学的发展，20世纪50年代后，人们逐步认识到这些从革兰阴性细菌分离得到的物质实际上是同一成分，并且是所有革兰阴性菌细胞壁外膜上的主要结构成分，对细菌的生长和活力至关重要，是革兰氏阴性细菌的主要致病因子，并将这些物质统称为内毒素或脂多糖（LPS）。从此，内毒素的研究，日益受到微生物学家、临床医师、生物学家和免疫学家的普遍重视。1988年，成立了国际内毒素学会（International Endotoxin Society，IES），1994年，创办了《内毒素研究杂志》。

    二、 LPS的分子结构及其特征

    LPS存在于革兰阴性细菌的外膜，由脂类和多糖组成。多糖又分为O多糖和核心（中心）多糖（Core polysaccharide）。 O多糖位于脂多糖最外层与环境相接触，是革兰阴性细菌的菌体抗原（O抗原），典型的O多糖由20～40个重复单位组成，每个重复单位由3～7个糖分子构成，因为各菌种的O多糖种类和排列顺序均不相同，因此，O多糖又称为特异性多糖，是革兰阴性细菌分类的重要依据。0多糖的结构是LPS 中最易发生变化的部分，并可引起特异性的免疫反应。核心多糖位于O多糖与脂类之间，可分为连接O多糖的外核部分和连接脂类的内核部分。核心多糖相对稳定，当LPS缺乏O 多糖时，它也能诱导抗体产生，但抗体的影响作用较小。内核部分含庚糖和2-酮基-3-脱氧辛酸（KDO）两种特殊的糖类分子，它们在LPS结构中起连接多糖与脂类的作用。脂类主要指类脂A，位于LPS内层由2个葡萄糖胺、磷酸盐和一定量的脂肪酸组成，为LPS中最稳定的部分。目前认为在LPS结构中只有类脂A及KDO部分具有毒性，此结构部分具有激活机体免疫系统的作用。

    三、LPS的识别机制

    单核-巨噬细胞、中性粒细胞是参与LPS应答的主要靶细胞，宿主细胞对LPS的应答曾被认为是细胞病理、生理和药理学活性的一个从启动到终止的过程。现已认识到LPS 能"识别"靶细胞并诱导其产生和释放具有免疫活性的细胞因子和其它宿主炎症反应介质。

    LPS诱导的细胞活化主要由LPS受体系统包括吞噬细胞表面上多种LPS受体。mCD14作为GPI锚蛋白存在于单核- 巨噬细胞及中性粒细胞膜表面，与LPS有较高的亲和力，是 LPS关键的膜结合位点，在LPS结合蛋白（LPS-Binding Pro tein，LBP）存在时，可介导低剂量LPS诱导细胞活化，释放炎症因子如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素1（IL-1）等，被认为是LPS信号传导中最重要的LPS受体。但近年来的研究越来越清楚地认识到：CD14缺少跨膜区，不能直接同细胞内信号分子进行交流，其功效可能是结合LPS，并使之局限于细胞膜的局部区域，传递并放大LPS的诱导作用。在介导的细胞活化中，必须借助于其它跨膜蛋白，但这种跨膜信号的传递机制目前尚未确知。

     四、 LPS的生物学效应

     LPS所引起的多种生物学效应并非是由于直接作用于靶细胞的结果，而是LPS首先直接作用于机体内单核-巨噬细胞，诱导其分泌多种介质分子，并借助这些介质分子在局部或随血液循环至全身各部分而发挥其生理作用。

在LPS诱导产生的多种介质分子中，细胞因子最为明显。其中TNF及IL-1是由LPS诱导产生并在免疫炎症及感染性休克病理反应过程中起关键作用。许多研究结果表明，高浓度的TNF单独作用便可引起某些类似于LPS介导的病理变化，如发热、出血、不可逆性休克乃至死亡。并且发现临床上感染性休克及败血症病人血中的TNF含量明显升高，且其含量与病人病情紧密相关。同样发现IL-1可诱导免发生败血症及休克。在引起细胞损害方面，发现LPS、TNF、IL-1之间存在协同作用，IL-1与TNF可协同介导内毒素休克的发生。IL-1和TNF协同作用以诱发血管扩张和白细胞介导的组织坏死，形成器官衰竭，乃至死亡。另外，由LPS刺激巨噬细胞产生的IL-6和IL-8具有类似于TNF及IL-1的作用。在败血症、休克病人中IL-1β、TNF及IL-6水平的增高与病人的死亡率相关，这些病人中IL-6是最易于持续增高的一种细胞因子，且与死亡率紧密相关。提示IL-6的异常表达和失调很可能是某些疾病的典型特征，从而使IL-6成为可能与发病机理直接相关的第一个细胞因子。动物模型和临床研究也表明宿主体内TNF-α和IL-6水平的高低直接与细菌感染疾病的严重性及预后相关。近年来研究发现TNF－α、IL－6与感染性休克关系密切。可见，在炎症及感染性休克发生过程中尽快检测细胞因子水平是很有意义的。

关于TNF或IL-1在革兰阴性细菌感染中的作用，一般认为TNF或IL-1产生的量及其所在部位对感染病人的病情发展有较大的影响，如果在肝和脾中产生适量的TNF或IL-1则有利于病人的预后；但若在血液中形成大量的TNF或IL-1，则只会加重病情。

    因此，LPS诱导单核-巨噬细胞产生的细胞因子，一方面可激活机体局部或整体免疫系统参与抵制细菌感染；另一方面若感染严重，机体内大量LPS与单核-巨噬细胞接触，产生大量炎性细胞因子而导致失控性炎症反应，导致感染性休克甚至器官衰竭。

五、内毒素的释放和移位

（一）内毒素的释放

革兰氏阴性杆菌菌体自溶或被裂解时释放内毒素，但这并非是细菌释放内毒素的唯一途径。在革兰阴性杆菌生长繁殖过程中，内毒素也不断从细胞壁上脱落下来并释放到周围的介质中去。

即使在营养物质贫乏的生理盐水中，细菌也能生长，加之内毒素性质比较稳定，如100℃时1h尚不能被破坏，必须加热至160℃经2-4h，或用强酸、强碱或强氧化剂加热煮沸30min才能灭活，因此，内毒素几乎无处不在。

（二）内毒素的移位

肠道中寄存着数目庞大、种类繁多的细菌，其中的大肠杆菌等革兰阴性菌不断向肠腔中释放内毒素。因此，肠腔不仅是“储菌所”，也是“内毒素库”，肠腔中的内毒素含量足以导致宿主死亡，但由于肠黏膜具有良好的屏障功能，故生理情况下仅有少量内毒素向肠外移位，而且这些内毒素很快被肝脏所破坏。但是，当化疗、休克引起的缺血缺氧、严重创伤、烧伤时的应激因素导致肠黏膜屏障功能受损时，内毒素向周围组织器官中或血液中移位，其移位途径包括：①经门静脉、肝脏进入体循环；②经肠道淋巴管进入淋巴系统；③穿过肠壁进入腹膜腔进而吸收入血。肠道细菌、呼吸道细菌等产生的内毒素引起的内毒素血症，称为内源性内毒素血症；创面感染灶或体内感染灶的内毒素也可以向血液中移位，来自于感染灶的内毒素、输注的液体中污染的内毒素等引起的内毒素血症，称为外源性内毒素血症。

肠道是巨大的“内毒素库”，特殊的解剖部位决定了肠黏膜必须是一道有效的防御屏障。肠黏膜屏障由黏膜上皮细胞形成的机械屏障和分泌型IgA（sIgA）等形成的免疫学屏障组成。

生理条件下，肠上皮细胞一般不吸收肠腔内的内毒素。有实验证明，经静脉注入的内毒素可以出现在肠上皮细胞中，但向肠道内灌注的内毒素只在肠腔内靠近肠黏膜的部位聚集，而不进入上皮细胞内。肠上皮细胞及细胞间紧密连接形成的黏膜机械屏障，是防御肠腔内毒素移位的一道重要屏障，保持完整性是其发挥防御作用的重要保证。

严重创伤、烧伤时，体液大量丢失，血容量不足，导致机体缺血缺氧。为维持血压、保证心脑等重要器官的血液供应，内脏血管代偿性收缩，其中胃肠缺血缺氧时间较其他器官更长，即使休克病人经液体复苏血流动力学回复正常后，胃肠道仍处于隐匿性休克状态。因此，当肠壁微血管恢复灌流时，肠发生缺血/再灌注损伤，上皮细胞产生大量的活性氧等介质，导致肠上皮细胞凋亡、细胞间紧密连接破坏，肠黏膜通透性因而迅速增加，机械屏障功能削弱，从而促使肠腔内的内毒素经肠壁吸收并向肠外组织移位。

活性氧是导致肠黏膜损伤的最重要因素。进入血液中的内毒素可以引起血管内凝血、微血管通透性增加及血压下降等病理生理变化，从而导致全身多个器官发生缺血缺氧性损害，而胃肠道又是最先受损的靶器官之一。

六、内毒素与人类健康的关系

内毒素不仅是决定革兰阴性菌感染的主要致病因子，而且与人类其它许多疾病关系密切，是一种危及人类健康乃至生命的最为重要的病原菌相关模式分子。目前研究最多、最为明确的内毒素相关疾病是革兰阴性脓毒症或感染性休克。随着有创技术、免疫抑制剂、细胞毒化疗，以及广谱抗生素使用增多，脓毒症和感染性休克的发病率自20世纪50年代以来一直呈增多趋势，在美国每年因其死亡人数达20万，儿童脓毒症病死率为10%-15%，成人则高达40%。据美国疾病控制和预防中心报道，脓毒症在美国为第12位死因。流行病学分析显示，80%的脓毒症与内毒素有关。由于脓毒症和感染性休克几乎都是继发于其它疾病，如创伤、烧伤、及免疫力低下的各种危重疾病，因此，脓毒症或感染性休克本身不应该被认为是一种独立的疾病，而只是发生于其它疾病过程中的一种并发症，因此，其治疗也应以预防或治疗原发病为主。

近年来，越来越多的实验显示，内毒素除引起危及生命的革兰阴性脓毒症外，也参与一些局部特定疾病的发生、发展。涉及到消化系统（如节段性回肠炎、溃疡性大肠炎、新生儿坏死性小肠结肠炎、急性胰腺炎、肝硬化、酒精性肝病、阻塞性黄疸等）、呼吸系统（如胆囊的纤维化、哮喘等）、心血管系统（如冠状动脉硬化）、泌尿系统（如溶血性尿毒综合征、血液透析或腹膜透析并发症）等多个系统的疾病。在这些疾病中，有的有较明确的革兰阴性致病菌，如冠状动脉疾病与幽门螺旋菌、肺炎衣原体有关，溶血性尿毒综合症与大肠杆菌O157：H7有关。所有病人的血中均可检测出细菌内毒素和（或）细菌内毒素抗体。然而，内毒素与这些疾病关系的报道多是初步的，其确切作用不像脓毒症那样已形成共识，尚需要更多的研究。