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利奈唑胺对万古霉素敏感及耐药屎肠球菌的抗菌活性
【摘要】 目的 评价利奈唑胺对临床分离万古霉素敏感及耐药屎肠球菌的体外抗菌活性。方法 多重PCR法鉴定屎肠球菌万古霉素耐药基因类型，平皿二倍稀释法测定利奈唑胺等11种抗菌药物MIC值。结果 75株临床分离万古霉素耐药屎肠球菌均携带vanA基因。万古霉素敏感及耐药屎肠球菌对利奈唑胺均敏感，MIC范围1～2mg/L。与红霉素、氨苄西林、左氧氟沙星和利福平相比，万古霉素敏感及耐药屎肠球菌的耐药率均在80%以上。万古霉素敏感屎肠球菌对高浓度庆大霉素、高浓度链霉素、四环素和氯霉素的耐药率分别为80.2%、13.9%、38.6%和37.6%；万古霉素耐药屎肠球菌对上述4种药物的耐药率分别为64.5%、8.0%、18.5%和5.3%。结论 利奈唑胺对我国临床分离万古霉素敏感和耐药屎肠球菌均具有很好的体外抗菌活性。
【关键词】 利奈唑胺； 万古霉素耐药； 屎肠球菌； vanA
The in vitro activity of linezolid against vancomycin susceptible
and resistant Enterococcus faecium
Li Yun, Zheng Bo, Liu Jian, Wang Shan,
Zhu Sainan, Xue Feng and Zhong Wei
(Institute of Clinical Pharmacology, First Hospital, Peking University, Beijing 100034)
ABSTRACT Objective To investigate in vitro antibacterial activity of linezolid against vancomycinsusceptible Enterococcus faecium (VSE) and vancomycinresistant Enterococcus faecium (VRE). Methods The van genes were detected by multiplex PCR and MICs of linezolid and other 10 agents were determined by the twofold agar dilution method. Result 75 VRE isolates were all carried vanA. All VSE and VRE isolates were susceptible to linezolid (MIC range 1～2mg/L), more than 80% of VSE and VRE isolates were resistant to erythromycin, ampicillin, levofloxacin and rifampin.The resistance rates of VSE to high level gentamycin, high level streptomycin, tetracycline and chloramphenicol were 80.2%, 13.9%, 38.6% and 37.6%, respectively. The resistance rates of VRE to the abovementioned agents were 64.5%, 8.0%, 18.5% and 5.3%, respectively. Conclusion Linezolid showed potent activity against vancomycinsusceptible and resistant E.faecium.
KEY WORDS Linezolid; Vancomycinresistance; Enterococcus faecium; vanA
肠球菌属引发的感染已占相当数量，且有逐年上升趋势。1999年Linden等〔1〕报道，在美国肠球菌属引发的感染占院内感染的12%，与肠球菌感染相关的病死率约13.1%，其中最严重、对患者威胁最大的是万古霉素耐药肠球菌(vancomycinresistant Enterococci，VRE)。万古霉素用来治疗革兰阳性菌引发的感染已有近50年历史。20世纪80年代末，欧美等国相继报道发现临床分离的VRE，我国近年万古霉素耐药肠球菌已经出现并且在逐渐增多〔2，3〕，VRE已成为世界性问题。在引起院内感染的肠球菌中约18%～50%对万古霉素耐药，尤其是万古霉素耐药屎肠球菌，对多种抗菌药物均耐药，如对青霉素的耐药率高达97%，对高浓度庆大霉素耐药率达52.1%，对高浓度链霉素耐药率达58.3%，给临床治疗带来巨大困难〔1〕。 利奈唑胺属于口恶唑烷酮类，通过与细菌23S rRNA结合抑制细菌蛋白合成而产生抗菌作用，对包括万古霉素耐药的葡萄球菌、肠球菌均有很强的抗菌活性〔4，5〕。本研究比较了利奈唑胺与其它10种抗菌药物对我国临床分离的万古霉素敏感及耐药屎肠球菌的体外抗菌活性。
1 材料与方法
1.1 试验药品
氨苄西林(批号0410200004，含量85.6%)、链霉素(批号0308200012，含量73.1%)、氯霉素(批号130303200614，含量99.3%)、庆大霉素(130326200314，含量63.8%)、红霉素(批号130307200114，含量92.3%)、四环素(批号130306200317，含量97.0%)、左氧氟沙星(批号130455200202，含量97.2%)和利福平(批号130496200001，含量99.0%)均购自中国药品生物制品检定所；万古霉素(批号WM15252，含量100.0%)为Lilly公司产品；替考拉宁(批号A2280，含量89.0%)为Sanofiaventis公司产品；利奈唑胺(批号20060301，含量99.96%)为Pfizer公司产品。
1.2 试验菌株
(1)标准菌株 VanA型标准菌株屎肠球菌WHO03和VanB型标准菌株粪肠球菌WHO14由国家细菌耐药性检测中心马越教授惠赠；ATCC29212为万古霉素敏感粪肠球菌标准菌株。
(2)临床菌株 收集2004年10月(2007年09月全国14个地区20家医院临床分离万古霉素耐药屎肠球菌75株，万古霉素敏感屎肠球菌(vancomycin sensitive E.faecium，VSE)101株，共计176株。每株细菌均来自不同患者。
每株细菌在试验前都经过平板转活分纯，以新鲜菌体用于试验。每次实验均用标准菌株作为敏感实验质控菌；用不含抗菌药物的平皿作为试验菌株生长对照。
1.3 培养基与孵育条件
在MH培养基，35℃孵育16～20h(万古霉素培养24h)。
1.4 PCR检测万古霉素耐药基因型
采用多重PCR法检测vanA、vanB、vanC1、vanC2、vanC3基因和粪肠球菌特异基因ddlE.faecalis、屎肠球菌特异基因ddlE.faecium。引物见表1。
(1)模板DNA的制备 将平皿上的单个菌落用50μl溶菌酶洗涤，混匀后37℃孵育10min，再加入50μl蛋白酶K和0.1mol/L TrisHCl(pH7.5)100μl，混 表1 PCR引物序列匀后37℃孵育10min即制成PCR扩增模板。
(2)PCR扩增 扩增反应总体积为10μl，其中10×PCR反应缓冲液1μl、20pmol/L引物各0.3μl、dNTP 0.8μl、模板DNA 0.5μl，其余为双蒸水。置DNA扩增仪上按以下条件进行扩增反应：变性，94℃，1min；退火，54℃，1min；延伸，72℃，1.5min，共30个循环，最后一个循环的延伸条件为72℃，5min。
(3)扩增产物分析 采用琼脂糖凝胶电泳法，以PCR marker为分子量标准，1.5%琼脂糖凝胶中80V电压电泳40min后0.5μg/mL溴化乙啶染色25min，采用凝胶成像系统观察结果。
1.5 最低抑菌浓度(MIC)测定
采用标准平皿二倍稀释法。被试菌悬液用多点接种仪接种，每点接种量为104CFU/ml。按照CLSI判定细菌对各种抗菌药物的敏感、中介和耐药率，其中高浓度庆大霉素和高浓度链霉素敏感性的判断标准为：庆大霉素≤500mg/L为敏感，>500mg/L为耐药；链霉素≤2000mg/L为敏感，>2000mg/L为耐药。
2 试验结果
2.1 PCR检测万古霉素耐药基因型结果屎肠球菌基因型的多重PCR分析及vanA基因均阳性，101株VSE只有屎肠球菌特异ddlfE.aecium基因阳性。
2.2 万古霉素敏感与耐药屎肠球菌MIC结果
表2为利奈唑胺与其它10种抗菌药物对VSE与VRE的MIC结果及菌株敏感、中介、耐药率。利奈唑胺对VSE与VRE均有很好的抗菌作用，MIC范围在1～2mg/L，MIC90值同为2mg/L，未发现中介及耐药菌株。红霉素、氨苄西林、左氧氟沙星和利福平对VSE的MIC90分别为>256、256、128和16mg/L，对VRE的MIC90分别为>256、>256、128和8mg/L。VSE和VRE对它们的耐药率高达80%以上。同为氨基糖苷类的庆大霉素和链霉素对VSE和VRE的抗菌活性明显不同，VSE和VRE对高浓度庆大霉素的耐药率分别为80.2%和64.5%，对高浓度链霉素的耐药率仅为13.9%和8.0%。四环素和氯霉素对VSE和VRE仍有较高水平的抗菌活性，耐药率分别为四环素38.6%和18.5%，氯霉素37.6%和5.3%。组间比较，VSE和VRE除对万古霉素和替考拉宁的耐药率有非常显著差异外，对氯霉素的耐药率也具有非常显著的差异(P<0.001)；对四环素和高浓度庆大霉素耐药率具有显著差异(P<0.05)，且均表现为VRE的耐药率明显低于VSE的耐药率，对左氧氟沙星的耐药率同样具有显著差异(P=0.029)，但表现为VRE的耐药率高于VSE的耐药率。对红霉素、氨苄西林、高浓度链霉表2 利奈唑胺与其它10种抗菌药物对万古霉素敏感和耐药屎肠球菌的抗菌活性素和利福平的耐药率两组间无显著性差异。
3 讨论
VSE和VRE对高浓度链霉素耐药率均低于国外报道〔6，7〕，但对其它非糖肽类被测药物的耐药率则高于国外报道，VSE耐药率更是明显偏高，比如对高浓度庆大霉素的耐药率，国外报道为28.2%，本项研究的结果为80.2%；VSE对氯霉素耐药率，国外报道为8.4%，本次检测结果为37.6%。此外，我国VSE与VRE对各类非糖肽类药物的耐药比与国外不同。在国外文献报道中，VRE对各类药物的耐药率几乎均高于或等于VSE的耐药率，如VRE对高浓度庆大霉素和左氧氟沙星的耐药率高于VSE〔6〕。而本项研究的结果显示，我国临床分离的VRE对非糖肽类药物如高浓度庆大霉素、高浓度链霉素、四环素和氯霉素的耐药率均低于VSE，对造成此现象的原因有待进一步研究。虽然VRE对四环素、高浓度链霉素和氯霉素的耐药率分别只有18.5%、8.0%和5.3%，为VRE感染的治疗提供了一种选择，但由于四环素和氯霉素无法单独用于治疗VRE严重感染以及链霉素的耳毒性和肾毒性，限制了其临床应用。
利奈唑胺为口恶唑烷酮类化学合成抗菌药物，2000年和2002年在美国已经分别批准用于成年人和新生儿，我国已于2007年9月用于临床。该药对多重耐药革兰阳性球菌有良好的抗菌活性〔8〕。本研究也显示利奈唑胺对我国临床分离的万古霉素敏感和耐药屎肠球菌均有良好的体外抗菌活性。
【参考文献】
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〔6〕 Sader H S, Streit J M, Fritsche T R, et al. Antimicrobial susceptibility of Grampositive bacteria isolated from European medical centres: result of the Daptomycin Surveillance Programme (2002～2004) 〔J〕. Clin Microbiol Infect,2006,12(9):844～852.
〔7〕 Nichol K A, Sill M, Laing N M, et al. Molecular epidemiology of urinary tract isolates of vancomycinrisistant Enterococcus faecium from North America 〔J〕. Int J Antimicrob Agents,2006,27(5):392～396.
〔8〕 刘昱东，王辉，杜娜，等. 利奈唑胺、替加环素、达托霉素、头孢吡普等抗菌药物对MRSA的抗菌活性〔J〕. 中国感染与化疗杂志，2008，8(1)：10～15. |
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