药物基因组学诊断技术开发进展

近年来，对影响药物疗效的基因组学研究及其多元诊断化验技术发展迅速。
日前，美国科研人员WalterH.Koch博士在《Nature Reviews Drug Discovery》9
月号上发表文章，介绍了药物基因组学诊断化验中使用较为广泛的技术的研发现
状。在刊发该文为国内医药科研人员提供参考思路的同时，也希望读者朋友积极
向本版提供国际医药领域科技最新进展的线索和资料，共同为我国医药科技的发
展建言献策。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　——编者按
　　　　　　　　　　　　诊断遗传变异提高药物疗效
　　过去三十年期间的研究表明，病原体的遗传变异与人的遗传变异一样已经形
成药物疗效产生个体差异的基础，如临床上出现的抗菌与抗病毒药物的耐药表现，
以及人类细胞色素P450药物代谢酶基因和编码药物结合酶[如N-乙酰转移酶（NAT
2）、硫嘌呤甲基转移酶（TPMT）和谷胱甘肽转移酶（GST）]等多种基因的遗传
变异。
　　■遗传变异的多样性
　　最初的人基因多态性研究表明，少数共同的变异以及绝大部分的不同酶活性
与药物疗效有关。但是，最近的研究提示，药物疗效的可变性与复杂疾病的基础
遗传学一起可能涉及许多不同的基因和变异，这些基因变异改变了蛋白质的表达
或功能。
　　遗传变异的数量和种类对药物疗效的影响已反映在整个人类基因组研究当中，
如研究单核苷酸多态性（SNPs）、插入或敲除、基因转化、完全的基因敲除、基
因复制和扩增等各种已知的变异类型。此外，个别基因或基因簇正日益被看作药
物疗效的生物标志物。这种基因组学变异的多样性对开发常规的试管内诊断化验
方法具有相当大的挑战性。例如，某些基因分型技术和化学方法广泛应用于一些
不同类型变化的探测，而其他的则相当有限，往往需要进行补充化验才能提供完
整的基因型。
　　■分子标记物与检测方法联动发展
　　基于聚合酶链反应（PCR）的化验与各种后PCR检测方法结合后就构成了大多
数分子诊断化验的基石，用于核酸分析，也用于药物基因组学开发。每一新发现
都为药物疗效的判断增加了复杂性，从而需要不断发展出可预期检测的生物分子
标记物。
　　在必须鉴定单个基因内（或在很少基因中交叉分布）的SNPs情形中，或确定
少数基因的不同基因表达时，可以应用实时均相PCR检测化验，以及其他一些复
杂程度较低的化验方法：诸如等位基因特异性PCR（AS－PCR）、TaqMan、杂交探
针融合分析、Invader探针、单碱基延伸（SBE，或微型顺序分析）与寡核苷酸连
接PCR反应（OLA-PCR）。这份清单并不意味着是详尽无遗的，在某些情形下，一
些不同的标记检测方法（如荧光、化学发光或者电气化学）以及仪器平台也可以
应用。例如，SBE基因分型反应可以通过毛细管电泳荧光、磁珠(Bead-based)结
合或微阵列通用Tag阵列、基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱仪
等各种方法进行检测分析。
　　当标记物的复杂性使得上述技术难以进行多样反应分析时，在单次化验中进
行多种标记物的检测就需要采用不同形式的阵列技术。应用这些基于等位基因特
异杂交或SBE的阵列技术可进行高度平行的基因型化验，如反象行墨点(Reverse
LineBlots)、寡核苷酸微阵列与磁珠技术等，用于多种单基因或多基因变量的同
步基因分型。
　　例如，十年前的固定式寡核苷酸探针“线性阵列”是用于开发人类白细胞抗
原（HLA）－A位点多态性分型的方法，这一方法也用于开发编码其他HLAs基因、
囊性纤维化跨膜转运调节物（CFTR）蛋白、人免疫缺陷病毒（HIV）耐药以及人
乳头瘤病毒亚型的基因分型化验。而在对高度多态性基因例如细胞色素P450的CYP
2D6基因的药物基因组学分析当中，可通过应用固定的寡核苷酸微阵列技术来简
化微阵列技术。
　　当与多元PCR反应结合时，高密度寡核苷酸微阵列技术是惟一能同步检测在
单一等位基因特异杂交反应中是否存在SNPs、插入和敲除、基因转换、完整基因
删除与基因复制事件的方法，对CYP2D6基因的寡核苷酸微阵列基因分型就是一个
例子。迄今为止，这是惟一能同步进行遗传变量的不同基因分型的检测方法。
　　■关注基因的差异表达
　　最近，研究人员已将注意力转向mRNA转录产物的全面分析，以鉴定出差异表
达的基因，这些基因在人类疾病生物学与药物疗效中发挥重要作用。
　　现在，微阵列技术的应用与成熟的数据分析工具设计已用于评价所有或大多
数的已知人类基因，从而比较正常组织与病变组织之间不同的基因表达方式，揭
示易于区别前者与后者的模式或“信号”。例如，基因表达模式可以显示特异基
因由于遗传变异、转录调节变化或后天影响而在特异的癌症标本中的“过表达”。
在某些情形中，过表达或表达不足的蛋白都可以作为药物靶标或药物疗效的调节
物。因此，基因表达信号可作为预期对特殊的药物治疗可能产生反应的分子标记
物。
　　癌症的巨大异质性使得高密度微阵列平台尤其适合用于发现癌症潜在的诊断
与预兆标记物；而蛋白质组分析技术，包括二维凝胶分析、MALDI-TOF质谱仪与
蛋白质阵列，正在提供补充信息，可能产生能指导癌症治疗决策的新诊断方法。
　　将遗传学、基因组学与蛋白质组学技术用于开发分子诊断学，能为改进治疗
选择和提高药物疗效提供许多机会。这种诊断学研究带来了许多挑战，包括生物
学与技术复杂程度的挑战，以及与多种分析物有关的新调整问题，如复杂的应用
仪器与化验方式以及用于解释检测结果的运算法则与软件等。
　　 传统方法的局限
　　阐明个体对一类或多类药物疗效的遗传变异特征最好的例子，是SNPs和其他
的编码药物代谢酶如TPMT、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6基因的变异形式。其中，
除了CYP2D6之外，其余均属于低复杂性的化验类型。
　　传统的SNPs基因型分析都采用的是PCR限制酶片段长度多型性（PCR-RFLP）
分析。当重要的多形位点没有限制酶主结构存在时，PCR引物可用于引导核苷变
化，为每一变异产生一个限制位点。这些诊断分析方法目前仍局限在研究中使用，
因为其操作很繁琐，而且工作强度大，难以用于常规临床诊断学的自动化或大批
量使用。
　　此外，这一方法还可能因不完全限制消化而产生错误的结果；这种方法需要
开放后PCR的反应管，采用限制酶进行扩增处理，这样就需要制备物理分离样本
来减少PCR遗留污染的风险。同时采用PCR装配与后PCR分析才可能避免PCR遗留污
染所产生的假阳性。
　　 杂交探针渐入临床
　　同质荧光基因分型方法是惟一经FDA批准的基因分型诊断方法。它应用了杂
交探针原理与FDA批准的LightCycler仪器，是为与静脉血栓症危险有关的基因型
因子VLeiden和因子II（凝血素）20210A的多态性设计的。该方法促成了等位基
因特异杂探针杂交的后PCR融合曲线谱的应用。在这一途径中，两种相邻的探针
被设计用于每一个基因多态性位点：利用荧光共振能量转移（FRET）原理的优势，
一种终端用供体染料标记，另一终端用受体染料标记。对这些探针最适宜的杂交
温度能确保两种探针在PCR引子炼合步骤中相邻并结合。对于标记物的定量测定，
在逆转录PCR（RT－PCR）期间，可在每个炼合周期中通过测定荧光信号来确定。
错配探针的融合温度比完美匹配低一些，从而容易区别是否存在两种等位基因的
变异。
　　这种方法也允许单一发光子报告染料与一对以上可被其杂交/变性最佳温度
区分的杂交探针一起使用。目前，研究人员已经开发了许多药物基因组化验方法
与这一平台进行研究应用，包括CYP2C9、NAT1和TPMT方法。
　　当前开发出来的一些具有同质荧光检测能力的Thermocylers以及具有增强酶
反应速率的耐热DNA聚合酶，已经降低了PCR反应与分析所需时间。运用这些新的
工具，PCR反应往往可以在15~20分钟内完成。由此，一种便携式的Thermocycler
仪器已被开发出来用于野外作业的生物制剂PCR检测。尽管PCR技术的这些进展可
能为未来某一刻基于PCR的临床常规化验提供基础，但仍然面临各种标本（包括
血液、口腔细胞、组织标本）的制备能否快速自动化的挑战，所以还难以进入临
床常规使用。
　　 AS-PCR与探针新技术
　　用于区别简单顺序变异的现代技术多采用等位基因特异杂交原理。等位基因
特异PCR（AS－PCR）用于两种相应引物的不同扩大效应检测，两者之间仅在其最
终的3''位点有所不同；每一种引物都是正常或变异等位基因的匹配补充物。每种
反应产物可以经凝胶分析或采用荧光染料同质实时检测或动力PCR检测而被检出。
　　在应用安全与自动操作方面，同质实时检测是对电泳分析方法的明显改进。
但一般而言，做荧光染料AS－PCR来查询每一种基因多态性需要至少二次PCR反应。
此外，AS－PCR依赖于PCR扩增时单独选择性的最优化过程，以保证那些结合到每
一反应试管中扩增子载体上的染料所产生的荧光信号能指示预期的扩增产物，而
不被引物中的二聚物等所干扰。
　　因为基因多态性的直接检测更适用于临床诊断，因而基因分型化验就必须经
常性进行，否则，还得检测两个或更多的多态性才能明确其结果。目前技术上已
经开发出各种多元途径如应用Taq鄄Man探针、杂交探针以及Invade探针等以满足
这种需求。现在，同质扩增与直接探针变量检测逐渐在单一和多元基因分型中推
广开来，其中最常用的方法是5''-核酸水解探针，也称为TaqMan探针检测。
　　两种不同标记的荧光TaqMan探针被设计为核苷差异中两种变异的完善匹配。
这些双标记探针可报告发光子经自然寡核苷酸探针结构中的受体染料的熄灭过程，
与两个等位基因特异TaqMan探针相关的荧光信号可以被实时定量测定，荧光亮度
随后来的每个扩增周期而增强。可测定的信号越过阈值（指定为CT）的周期长短
被用来判断是否在标本中存在两种纯合子等位基因中的一种，还是存在杂合状态。
　　PCR反应与TaqMan探针都容易进行，可获得相似的扩增与检测效果，并促进
确定CT截止点与开发检测运算法则，能可靠地“识别”每一个多态位点。应当注
意的是，在任何等位基因特异的检测探针方法（包括TaqMan探针基因分型）中，
如果SNP的少数核苷内存在另外的多态性，就可能干扰TaqMan探针基因的分裂。
　　总之，TaqMan等位基因的特异基因分型分析是可自动化的、快捷、高度可重
复的。美国食品药品管理局（FDA）最近已批准COBASTaqMan仪器用于采用TaqMan
技术的试管诊断自动控制技术。
　　 高密度微阵列的应用
　　高密度寡核苷酸微阵列为基于磁珠的检测方式提供了新的选择，并且具有更
大的多元检测能力。其在多元PCE反应中，原则上仅受限于选择性扩增基因组范
围的能力。例如，采用目前的制造工艺，一个1～2平方厘米的玻璃Affymetrix微
阵列可以容纳一百万以上独特的寡核苷酸顺序，每一序列的空间定位于11平方微
米位置内。这种类型的阵列与灵敏的扩增方案相结合，能够对人类基因组范围内
成千上万种SNPs进行基因分型。这些工具目前正用于大规模的、基因组范围的联
合研究，以发现人类疾病的遗传生物学标记。
　　此外，运用完整的晶圆阵列与数千万的寡核苷酸探针平铺于整个染色体区域
的方式，目前正运用于常见遗传变异的基因组SNP发现当中。高密度的寡核苷酸
探针正用于一些基于基因表达的诊断方法的开发之中，对没有诊断的基因分型也
多是运用这一程度的探针密度。高密度特征的研发使得阵列的体积相对较小，成
本较低，同时还可提高多态性检测的精确度。
　　为了采用高密度寡核苷酸微阵列进行基因分型，基因中的重要区域首先应被
PCR扩增，然后靶标扩增被DNase I分裂，终端采用生物素标记，并在严格的条件
下杂交。其杂交产物 Amplicons采用抗生物素－藻红蛋白共轭物染色，与特异探
针特征性结合的荧光可被激光照明的共焦扫描仪检测到。基于寡核苷酸阵列的化
验往往运用一套完美匹配与一套错配寡核苷酸之间的比较荧光信号来检测多态性，
同时减少交叉杂交的影响。通过应用已知基因型的测试标本进行软件与运算法则
练习，可以鉴定标本中存在的多态性、等位基因与基因型。这种方法已经用于Roche
AmpliChipCYP450基因型化验的开发。运用这一方法，现在所有的CYP2D6已知多
态性与等位基因以及两种最常见的CYP2C19都可以同时进行分析。最近，AmpliChip
CYP450已被设计用于分析30多种基因多态性，这些多态性是所有地区人群中包括
正常、降低、无效活性的各种等位基因的复制基础。
　 　微阵列分析与基因差异表达
　　药物基因组学中的基因表达分析目前主要应用于创新药物研究和开发。同时，
基因表达谱已经开始为慢性致命性疾病的药物治疗效应提供预测信息，并指导治
疗选择，而寡核苷酸微阵列平台具有应用于药物基因组学研究的潜在优势。
　　■微阵列分析的特点
　　与DNA顺序分析和基因分型不同，微阵列基因表达分析的分析物是信使RNAs
（mRNA）。信使RNAs的不稳定性要比DNA大得多，对操作方面的要求非常高，以
避免由于Rnase酶降解而产生假象。此外，信使RNA在经PCR产生DNA拷贝扩增之前，
或在大多数的微阵列分析中，或在产生cRNA拷贝的试管内转录（IVT）线性扩增
程序中，都是逆转录形成cDNA的。在IVT反应期间，cRNAs都被标记，而在杂交到
寡核苷酸阵列时往往被分裂。
　　在研究中，基因表达阵列常常采用被标记的cRNAs或长寡核苷酸作为固定探
针，以及由类似于半导体工业应用的光刻技术制造的寡核苷酸探针阵列；寡核苷
酸探针可直接在微阵列表面合成，还可以应用多空间的完美匹配单碱基－错匹配
探针对来查询每一个重要的基因。这种高密度寡核苷酸探针诊断方法可检测出拼
接变异种的能力，以及因特殊转录而造成融合基因时产生的特异性嵌合转录（如
慢性髓细胞白血病中的BCR－ABL）。
　　目前有很多种途径来对成千上万的探针强度数据点进行数据分析，最近提出
的是临床应用表达类型的最佳实用指导方针。各种全自动化的分析方法（如层次
聚类算法与运用自组织图）可供用于确定具有相似表达类型的分组基因之间的关
系。同样，还有一些需操作人员监管的分析方法（如支持向量机），可应用同质
的PCR检测平台进行药物效应的基因显型检测，以筛选和鉴定最可能有效的患者。
　　■促进肿瘤诊治水平提高
　　基因的表达差异是药物疗效的基础。基因表达的各种分析方法正在开发过程
中，为疾病，尤其是肿瘤的治疗选择提供分子图表类型信息。例如，常见的急性
成人或儿童白血病的微阵列基因表达分析可以鉴定与特殊染色体易位或删除有关
的分子图表类型，这样可以选择不同的治疗方案。此外，在药物开发期间常规地
进行肿瘤组织的基因表达分析，有可能鉴定出能预测药物效应的表达类型。
　　现在，科研人员通过分析在乳腺癌细胞株中5氟尿嘧啶（5-FU）诱导的基因
表达，已经确定了与耐药和疗效有关的基因；取自针吸活检的mRNA的寡核苷酸微
阵列分析获得的基因表达类型能预测乳腺癌患者服用多烯紫杉醇（Docetaxel）
的疗效；对B系急性成淋巴细胞白血病患儿的白血病细胞所做的基因表达分析已
经鉴定出来一套不同表达的基因，它们与对强的松、长春新碱、天冬酰胺酶制剂
或柔红霉素的敏感性或耐药有关——这些信息在未来可用于指导治疗选择。
　　采用寡核苷酸微阵列的基因组分析可以结合生物信息分析，以精选出对诊断
测试开发具有高度预测价值的最精简的不同表达基因，以便可用于低复杂性的诊
断化验之中。例如，在预期乳腺癌患者服用他莫西芬的疗效时，将雌激素受体阳
性者的基因表达信号减少到两个基因表达比率，有助于开发简单的RT－PCR测试
方法。
　　 Invader化验仍待完善
　　用于基因分型SNPs的另一种化验方法是应用InvaderOligos[重迭分裂探针与
Cleavase，一种结构特异的5''-flap核酸内切酶（FEN）]。
　　与PCR不同，Invader化验是扩增一个靶标特异信号，而不是靶标的等温反应。
虽然同质的Invader化验在某些情形可以直接从基因组DNA进行，但是这种方法在
分析一个高度同源的基因族的基因分型成员时，或存在假基因时，通常需要一个
PCR步骤，以避免不利的交叉杂交。对于多态性检测来说，当先后杂交后靶标区
域时，一个Invader寡核苷酸探针可通过一个碱基来交迭一个等位基因特异的检
测探针。这种只有在完美匹配存在时才产生的结构形成的构造就是Cleavase的底
物；非杂交的''5''-flap''是通过分裂与杂交到二级反应的FRET盒而释放的，由此
产生另一个Cleavase的底物。这种二级底物的分裂与荧光基团的熄灭分开，可产
生采用标准的荧光能读取机读取的一个荧光信号。
　　现在，一种Biplex样式的化验方法已经设计为应用两种独特的初步检测探针
与FRET试盒，采用不同的荧光染料标记探针，能在单次反应中检测到两种等位基
因的变异。
　　CYP2D6基因编码异喹胍4-羟化酶，这种酶主要在肝脏表达，能代谢20%~25%
的药物（包括精神病与心血管疾病的许多治疗药物）。为检测大量的多态性，CYP
2D6的基因分型可能需要与同质扩增系统进行许多单个反应。目前一些基于TaqMan
探针技术的研究测试已被开发用于检测最常见的白人CYP2D6有缺陷的等位基因，
但这些方法通常局限于3种或4种SNPs。
　　现在，人们运用Invader技术正在开发一种能在CYP2D6基因内用于11种多态
性基因分型检测的方法。但是，Invader化验并不能常规性地确定哪种CYP2D6等
位基因被复制。对于CYP2D6基因分型来说，每一种由In鄄vaderBiplex反应提出
的多态性均需要应用PCR扩增子载体的可分量。为便于自动操作，这些反应通常
是在96孔或384孔平板上进行，所以，应在常规临床诊断应用中避免产生PCR污染。
　　自从PCR出现以来，人们已经开发出各种多元分析方法，包括等位基因特异
的寡核苷酸（ASO）DotBlots或线性阵列、基于磁珠的“Tag阵列”与各种类型的
高密度寡核苷酸微阵列。其中，磁珠与微阵列方法是最易于自动操作的。
　　基于磁珠的基因分型化验的一个例子是对基因分型12CYP2D6多态性的研究应
用。这种化验应用聚苯乙烯微球体来吸附寡核苷酸的“抗标记”顺序。每种独特
的加标记的微球体含有一种具有独特光谱的特殊染料。这样的结合使得磁珠可以
容易检测，并且与LuminexxMAP流式仪器中另一种采用激光计算的方法相区别。
运用引物扩展组合荧光团（与一种特殊色彩的微球体联合）的流式检测，可以使
单一试管中的基因型确定多路技术检测出48种标记物。
　　 文/余志平 编译

在这一方面需要好好学习，谢谢版主

谢谢版主