P450酶介导的代谢性药物相互作用－－节选自《药物相互作用基础与临床》

刘治军 · 发表于 2010-11-10 13:49:33

1.细胞色素P450酶
药物在体内的生物转化涉及到专一性酶和非专一性酶两类催化酶，前者指选择性高活性强的酶，如胆碱酯酶、单胺氧化酶等。非专一性酶主要指混合功能氧化酶系统，以细胞色素P450为主，由于P450蛋白与一氧化碳（CO）的结合体P450-CO在450 nm处有特征性强吸收峰而得名。P450酶系由许多结构和功能类似的同功酶组成一个庞大的家族，可催化多种类型的反应，参与许多外源性和内源性物质的代谢。

Nehert及其同事提出了通用的系统命名法[2]，将同工酶及基因分为家族和亚家族，以"CYP"为词首来命名所有物种的细胞色素P450同工酶（果蝇及鼠基因用'Cyp'）。在该系统中，所有来源的细胞色素P450蛋白的氨基酸若有40%以上的同源性，则归于同一家族，并以阿拉伯数字来标示。亚家族酶则由氨基酸顺序有55％以上同源的酶组成，以大写字母标示，字母后面的阿拉伯数字表示不同的酶，与酶相关的基因则用斜体字表示。比如，CYP2家族有诸如CYP2C、CYP2D、CYP2E等亚家族，数字代表不同的酶，如CYP2D6，基因则用CYP2D6表示。因这种命名法的优点是很易识别结构一致或高度相似的细胞色素P450，被广泛接受。据估算[3]，约有60%的处方药经过CYP代谢。在已经确定的细胞色素P450的18个家族42个亚家族中，参与药物转化的主要是CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 5种，占CYP代谢总量的95%。约有55%的药物经CYP3A4代谢，20%的药物经CYP2D6代谢，15%的药物经CYP2C9和CYP2C19代谢。
因此，如果因遗传因素或药物因素造成不同个体P450酶活性差异，则会影响底物药物的代谢，导致药物浓度升高而中毒，或者药物浓度降低而治疗无效，甚至出现罕见的不良反应。CYP被抑制或被诱导是导致代谢性药物相互作用的主要原因，据日本学者（千叶宽，1998）估计，酶抑制作用所致DIs约占代谢性相互作用的70%，酶诱导作用引起的药物相互作用约占23%。

2.P450酶的抑制
药物对CYP的抑制有三种类型：（1）竞争性抑制（mutual competitive inhibition），通常发生在两种药物都是同一个酶的底物时，会产生底物之间的竞争，抑制了彼此的代谢。如环孢素和地尔硫卓之间存在底物水平的竞争性抑制；（2）机制基础抑制（mechanism-based inhibition），也叫自杀性抑制，如大环内酯类抗生素在肝脏经CYP3A4代谢，脱去氨基糖分子中叔胺基的N-甲基，此代谢物与P450分子中血红蛋白的亚铁形成亚硝基烷烃（nitrosoalkane）复合物而使酶失活（图2-9）。14员环的红霉素和克拉霉素与CYP3A4形成复合物的作用最强，罗红霉素和16员环的交沙霉素、美欧卡霉素、螺旋霉素等次之，最弱者为15员环的阿奇霉素。（3)非选择性抑制（nonselective inhibition），指药物对多个CYP同功酶都有抑制作用，缺乏选择性。如西咪替丁咪唑环上的N与CYP亚铁血红素部分的配体非选择性的结合，引起酶活性障碍。由于每个CYP都有亚铁血红素配体，因此西咪替丁对大部分的CYP都有抑制作用，但主要抑制CYP3A4，其次是CYP2D6。另外，酮康唑、咪康唑、伊曲康唑、克霉唑中的杂环氮原子非特异地与CYP血红蛋白中的铁原子结合，从而抑制CYP活性。特比萘芬不含杂环氮原子，因此对CYP没有抑制作用。

图2-9 亚硝基烷烃复合物形成示意图

按照抑制剂对酶抑制的性质不同，又可以分为可逆性抑制和不可逆性抑制，后者又包含缓慢可逆性抑制。可逆性抑制根据抑制剂对酶抑制部位的不同，又分为竞争性抑制（competitive inhibition）、非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）和反竞争性抑制（uncompetitive inhibition）。竞争性抑制中，抑制剂和酶的底物竞争同一（催化）结合位点，符合公式1-1。通过增加底物的浓度，仍然可以达到最大的底物代谢反应速度（Vm），而表观Km值升高；
V（i） =       [1-1]
非竞争性抑制中，抑制剂和底物分别作用于酶的不同部位，因此，抑制剂的抑制作用不能通过增加底物的浓度来消除，抑制剂降低了酶对底物的最大代谢速度（Vm），符合公式1-2。
V（i） =    [1-2]
反竞争性抑制抑制剂与底物-酶复合物结合而抑制酶的代谢过程，这种情况下，增加底物浓度，只能加重抑制剂的抑制作用。因此抑制剂存在情况下，Km和Vm都降低，符合公式1-3。
V（i） =          [1-3]
然而，在临床实践中，反竞争性抑制是非常罕见的，因为在体内环境中，底物-酶饱和现象很少发生，而且体内底物的浓度通常远远小于Km，其消除过程通常是一级动力学过程，因此不管是否有竞争性或非竞争性抑制剂存在，底物的代谢速率与底物的浓度无关。

在缓慢可逆性或不可逆性抑制中，由于酶的代谢物与酶形成不可逆的复合物从而最终全部抑制酶活性，需要一定的时间的，比如对于红霉素抑制CYP3A4来说，在体内可能需要使用红霉素1-3天的时间才能完全抑制此酶活性[4]。但是对于某些药物，如醋竹桃霉素（troleandomycin）完全抑制CYP3A4可能需要的时间更短，有研究显示口服醋竹桃霉素500mg，2小时后静脉给予的咪达唑仑的代谢（经CYP3A4）就被明显抑制。形成缓慢可逆复合物（slowly reversible complex, MI复合物）的常见药物包括大环内酯类抗生素、三乙酰竹桃霉素(triacetyloleandomycin)、竹桃霉素（oleandomycin）、红霉素、克拉霉素、罗红霉素以及抗抑郁药物氟西汀、去甲替林、地昔帕明、米帕明和胺碘酮、地尔硫卓和他莫昔芬等。

一般来说，由于MI复合物解离时间较长，可能超过酶蛋白的存活时间，因此，对于形成MI复合物而能有效抑制酶活性的情况，并不需要酶被抑制剂饱和，而只需要抑制剂持续存在并抑制酶活性，持续存在的初级或次级抑制性代谢物的积累和最终形成酶-抑制剂复合物。比如研究发现，体内红霉素要有效抑制CYP3A底物环孢素、特非那定和阿芬太尼的代谢，需要多剂量给药[5-6]。重复给予红霉素500mg/d血浆中药物浓度约为5-6μM，低于红霉素对CYP3A的Ki（16-194μM），因此一般认为，红霉素对CYP3A的抑制作用主要是由于代谢物形成了MI复合物，而不是因为红霉素本身对CYP3A的快速可逆结合。

抑制剂对酶抑制活性的强度取决于：（1）抑制剂的起始浓度；（2）酶对抑制剂（前药）代谢的效率和（3）抑制剂代谢物与酶复合体的稳定性。如果形成的抑制剂-酶复合体不能在正常的酶蛋白降解前分离，这种抑制就可以看做是不可逆性抑制，或者自杀性抑制。类似的经典例子还包括17α-炔类固醇类[7]，如炔雌醇（ethinyl estradiol）和孕二烯酮（gestodene）都通过CYP3A4代谢后与血红素不可逆的结合。

FDA在《FDA关于药物相互作用研究指南（草稿）》2006版中提供了酶抑制剂活性的分级标准[8]：根据体内实验中CYP抑制剂对合用的最适底物或其它底物的血浆AUC升高的倍数，对酶抑制剂进行分级：如果受试药物升高了同时服用的底物药物AUC5倍，则列入强抑制剂组；如果AUC2倍而<5倍，则列入中等抑制剂组，如果AUC升高在1.25-2倍间，则列入弱抑制剂组。

部分酶抑制剂的分级见表2-1，常见的P450酶敏感底物和安全范围窄的底物见表2-2。

3.P450酶的诱导
尽管体内酶诱导现象比较少见，但是敏感酶的诱导能严重影响药物的体内代谢。多数酶诱导现象是由于酶蛋白合成的增加，包括（1）mRNA翻译活性的增加；（2）mRNA稳定性增加，翻译后的降解减少；（3）DNA转录增加。目前发现，CYP1A2、CYP3A4、CYP2C和CYP2B可被诱导，其中CYP3A对所有已知的诱导剂都很敏感。研究也证实，P450酶诱导作用机制与核受体超家族有关。

CYP1A1/2诱导机制研究比较成熟[9]，药物与胞浆中的芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）结合，导致热休克蛋白90从受体上分离，引导受体配体复合物进入细胞核，与Arnt蛋白结合形成复合物，AhR-Arnt复合物与CYP1A基因上的反应元件结合，导致基因转录增加。香烟中的某些成分和某些药物就是通过这个途径诱导肝脏CYP1A2和肝外组织中CYP1A1。AhR也参与了UGT1A6的诱导机制。

核受体超家族成员参与CYP酶诱导，其中组成型雄烷受体（constitutive androstane receptor, CAR）、孕烷X 受体（pregnane X receptor, PXR）和过氧化物酶体增殖体激活受体( peroxisome proliferators-activated receptors, PPAR)分别在介导肝脏CYP2、CYP3 和CYP4 家族同工酶诱导中发挥作用，此外，法尼醇衍生物缓慢激活法尼醇X 受体（farnesol X receptor, FXR）和肝脏X 受体（liver X receptor, LXR），在肝脏P450酶诱导表达中也起一定作用。这些调控性核受体都属于同一个核受体基因家族，它们具有共同的异二聚体伴侣――视黄醛X受体（retinoid X receptor，RXR），RXR与其它核受体或多种细胞内信号途径产生交互作用。研究发现，这些核受体具有明显的种属特异性[10]，这些核受体是调节Ⅰ相代谢酶、Ⅱ相代谢酶和选择性药物转运蛋白表达的感应器，对阐明控制药物代谢酶表达的遗传机制有重要意义。

在正常肝细胞中，CAR与其内源性抑制性配体――雄激素代谢产物32-雄甾(烷) 醇结合，而处于无活性状态。内源性CAR存在于肝细胞胞浆中，此时不能影响基因转录。当苯巴比妥作用于肝细胞时，经某种磷酸化依赖机制，CAR从细胞浆转移到细胞核, 并且与32-雄甾(烷) 醇的结合能力大大降低，导致CAR与RXR结合并形成异二聚体，通过与苯巴比妥反应增强子(phenobarbital responsive enhancer module, PBREM) 结合促进了CYP2B的转录。苯巴比妥、苯妥英、卡马西平、扑米酮及环磷酰胺、异环磷酰胺等都是CYP2B的诱导剂。

人PXR基因位于13号染色体q11-13臂，全长35 kb，含有9个外显子。基因测序发现，PXR基因存在38个SNP位点，其中有6个在编码区，3个为同义突变，3个为非同义突变。编码区的3个非同义突变，形成了PXR的新的等位基因，包括PXR3 2 (P27S, 79C→T)、PXR3 3 (G36R,106G→A)和PXR3 4 ( R122Q, 4321G→A)。PXR介导型诱导CYP3A基因，该基因的调节部位为地塞米松(DEX) /孕烯醇酮16α-腈(pregnenolone 16α-carbonitrile, PCN)反应元件，当外源物进入细胞后，直接与核内PXR配体结合区(ligand binding domain，LBD)结合,后者再与RXR 结合形成异二聚体，最后该二聚体与DEX/ PCN 反应元件结合，诱导CYP3A 基因的表达[11]。抗肿瘤药物紫杉醇（paclitaxel）在体内经CYP3A4代谢，但其本身能激活PXR，诱导CYP3A4加快代谢。紫杉醇类似物多西他赛（docetaxel）不激活PXR，所以口服生物利用度比紫杉醇高。另外，因致命肝毒性而被撤市的抗糖尿病药物曲格列酮（troglitazone），在治疗剂量时能活化PXR，并由CYP3A代谢生成具有潜在肝毒性的苯醌，而类似药物吡格列酮（pioglitazone）不激活PXR，活性苯醌大大减少，肝毒性大大减小[12]。

临床发现，多种药物能通过激活PXR诱导肝药酶。圣约翰提取物（St. John’s wort）（即我国的贯叶金丝桃提取物，由于我国目前没有相关产品上市，相关的药物相互作用研究也都是圣约翰草提取物，因此本书采用了这个称呼，避免读者查阅时还要把圣约翰草转换为贯叶金丝桃）是欧美广泛应用的轻、中度抑郁症的治疗药物。报告基因研究证实了临床的观察，圣约翰提取物能激活PXR并诱导CYP3A4的表达[13], 同时还能诱导CYP2C19的表达，增加奥美拉唑等底物的代谢。硝苯地平、螺内酯、洛伐他丁、曲格列酮、利托那韦、他莫昔芬、紫杉醇和利福平等药物都能激活PXR，诱导CYP3A4和CYP2C19等药物代谢酶。

PXR也具有重要的生理功能。石胆酸（lithocholic acid）是一种有肝毒性的疏水性次级胆汁酸。动物实验表明，石胆酸可造成肝内胆汁淤积，而引起经胆汁排泄的毒素在肝脏积聚，造成肝脏损害。石胆酸和其他有肝毒性的胆汁酸通过I相羟基化反应和II相结合反应，增加胆汁酸的亲水性，促进其肾排泄。肝脏的羟化反应是石胆酸和其它胆汁酸代谢和排泄的一个核心步骤，是预防胆汁淤积和肝损害所必需。石胆酸的6-羟化是在CYP3A的催化下进行的。研究发现, PCN ( PXR激动剂) 预处理可避免石胆酸造成的鼠肝脏损伤。PCN的这种保护作用在PXR基因敲除的大鼠中则消失。推测PCN通过激动PXR，诱导CYP3A促进石胆酸的羟化代谢减少其毒性。研究发现，PXR能被石胆酸及其代谢产物激活，从而调节参与胆汁酸合成、转运、代谢的基因,如CYP7A1、Oatp2和CYP3A，维持着胆汁酸的体内平衡。因此Staudinger等[14] 认为，PXR是石胆酸的一种生理传感器，协调基因的表达，以减少毒性胆汁酸的浓度。
一般来说，CYP2D6不能被诱导。

4.P450酶基因多态性
早在20世纪70年代，就发现异喹胍和司巴丁的代谢呈多态性，通过对遗传机制的研究发现，其代谢差异是由CYP2D6基因多态性所致。CYP2D6基因的主要突变方式是单个碱基的缺失或替换引起读码框架移位或是大片段基因的丢失。目前已发现CYP2D6 有70多种突变基因，其中超过15个突变基因翻译后是无活性状态或非酶结构，而另外一些突变翻译后分别为活性降低、活性正常或活性增强的CYP2D6，从而造成人类对药物反应的个体差异。据此，可将人群分为4种类型：超快代谢型（ultra-rapid metabolize，UM）、正常代谢型（extensive metabolizer，EM）、中间代谢型（intermediate metabolizer，IM）和慢代谢型（poor metabolizer，PM）。UM是由于CYP2D6 多基因拷贝，使酶蛋白高表达，导致酶活性显著升高。EM 是正常人群的代谢表型，是纯合子正常等位基因产生的正常表达量的酶，但有些杂合子的酶蛋白仍然表达正常，也表现为EM。PM是由于基因突变造成酶蛋白分子结构或构象的改变，从而产生酶蛋白功能缺陷。最常见的非编码等位基因是CYP2D6 3 4、CYP2D6 3 5、CYP2D6 3 6 和CYP2D6 3 3，分别占无效等位基因的71 %、16 %、6 %和4 %。这种非编码等位基因会导致酶活性丧失。慢代谢型的发生率存在种族差异：白种人慢代谢型发生率为6%～8 %，亚洲人为1 % ，非洲人为1.8 %。大约75%的慢代谢者是由CYP2D6 3 4引起，在白种人中，CYP2D6 3 4的频发率为22 % [15]。

CYP1A也具有基因多态性。对于CYP1A1来说，除了存在AhR基因多态性而影响了CYP1A1的可诱导活性外，CYP1A1基因本身也存在多态性。AhR存在高亲和力和低亲和力2种受体，大约10%的人群属于高亲和力受体类型，而90%属于后者[9]。CYP1A1存在4个基因多态性位点，分别为m1（与日本人肺癌增多有关）、m2（Ile462→Val，导致酶活性升高50%，和谷胱甘肽S-转硫酶μ（GSTM1）突变一起导致日本吸烟者肺癌发病率增高9倍）、m3（位于内含子7，只在非裔美国人发现）和m4（外显子7，Thr461→Asp，可能与肺癌无关）。CYP1A2也存在基因多态性，如检测21个肝组织发现CYP1A2 mRNA的含量相差43倍，而检测22个肝组织CYP1A2介导的咖啡因N3-去甲基反应或4-苯基苯胺N-氧化反应（4-aminobiphenyl N-oxidation）分别相差57倍和130倍[16-17]。
CYP2C家族也存在基因多态性。S-美芬妥英（Mephenytoin）在体内可被CYP2C19迅速芳香环羟基化代谢，但是在白种人中，约有2%-5%的个体表现为代谢缺陷，进一步研究发现，这一变化是缘于CYPC2C19的外显子5的G→A的突变（CYP2C19*2），导致读码框位移，翻译出一个没有活性的酶蛋白[18]。Goldstein等又在亚洲人群发现了位于外显子4的CYP2C19*3等位基因[19]。这两个突变导致了99%的亚洲人CYP2C19的慢代谢型。最近也发现了CYP2C19*4和CYP2C19*5（Arg433→Trp）突变会导致翻译的酶蛋白丧失活性。

已经证实，CYP2C9基因存在R144→C(CYP2C9*2)和I359→L（CYP2C9*3）等位基因，这两个等位基因的变异导致CYP2C9在种族间表达的差异，其中白种人的突变率在10%左右，而中国人或非裔美国人低于2%[20]。CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因突变，产生的是有功能的蛋白，但是酶活性降低。这种基因多态性在药物开发中也导致过复杂情况：氯沙坦（losartan）是CYP2C9 底物，在临床进行的200人的队列研究中发现，有2人出现代谢异常，没有将氯沙坦转化为酸代谢物，最后确认两个人是CYP2C9*3突变者。其中的一个人继续进行CYP2C9底物甲苯磺丁脲和苯妥英试验，跟预期的一致，探针药物甲苯磺丁脲和苯妥英的消除半衰期大大的延长[21]。

相对来说，CYP2E1属于保守的基因，有功能性的突变更是罕见。