阅读原文： 伏立康唑和泊沙康唑作为新一代的三唑类药物， 与其它三唑类药物相比，抗菌谱更广，抗菌作用更强， 且耐受性较好［1－2］。伏立康唑受基因多态性影响，且易与多种药物发生相互作用，体内药浓度个体差异较大［3］。泊沙康唑在吸收过程中易受多种因素影响，导 致血药浓度不达标［4］。因此，临床对其两者进行血药浓度检测有十分重要的意义。本试验建立液相色谱－串联质谱( LC － MS /MS) 法同时测定人血浆中泊沙康唑和伏立康唑的浓度，用于临床血药浓度的监测。
材料与方法 1 材料 药品 及 试 剂 伏 立 康 唑，纯 度: ＞ 98% ，批 号: PHSHH － AE，购自化成工业发展有限公司; 泊沙康唑 纯度: 100% ，批号: K2TPE － MA，购自化成工业发展有 限公司; 伏立康唑 － d3 标准品，纯度: 100% ，批号: 5 － JUZ － 42 － 1，泊沙康唑 － d4，批号: 6 － JUZ － 55 － 2，均 购自美国 TＲC 公司。 仪器 LC － 30A 高效液相色谱仪，日本岛津公司产 品; LCMS 质谱检测器，美国 AB Sciex 公司产品。
2 测定条件与样品处理 色谱条件 色谱柱: Waters Symmetry C18( 2. 1 × 50 mm，3. 5 μm) ，流动相 A: 乙腈溶液( 含 0. 1%甲酸) ，流动 相 B: 5 mmol·L －1甲酸铵水溶液( 含0. 1%甲酸) ，梯度洗 脱( 0. 01 ～1. 50 min，70% B; 1. 50 ～ 3. 50 min，30% B; 3. 51 ～4. 50 min，5% B; 4. 51 ～ 6. 50 min，70% B) ; 流速为 0. 3 mL·min －1; 柱温为40 ℃; 进样量为1 μL。 质谱条件 离子源: 电喷雾离子源( ESI) ，以正离 子模式，多反应监测( MＲM) 扫描方式进行定量。离子源电压为 3. 0 KV，离子源温度为 550 ℃，雾化器压力为 275. 8 kPa，加热器压力为 275. 8 kPa。伏立康唑离子对 为 m/z 349. 9 →126. 9，内标离子对为 m/z 353. 2 → 284. 2，碎裂电压均为65 V，驻留时间均为200 ms; 泊沙康唑离子对为 m/z 701. 4→614. 3，内标离子对为 m/z 705. 3 →687. 4，碎裂电压均为100 V，驻留时间均为200 ms。
对照品工作液制备 精密称取伏立康唑及泊沙 康唑对照品适量，分别用甲醇: 超纯水( 1∶ 1，v/v) 及溶 剂甲醇: 超纯水( 8∶ 2，v/v，含 0. 4% 甲酸) 配制成质量 浓度均为 1 mg·mL － 1的对照品储备液，再用溶剂甲醇: 超纯水( 1∶ 1，v/v) 稀释制成所需质量浓度的标曲工作液，得到伏立康唑及泊沙康唑质量浓度分别为 0. 5，1，2，5，10，20，50，100 μg·mL － 1 的标准系列溶液。以上配制的溶液均在 4 ℃下保存备用。
内标工作液制备 分别精密称取内标对照品，采 用与其待测物相同的溶剂配制成 1 mg·mL － 1 储备液， 按一定比例混合后，用溶剂甲醇: 超纯水( 1∶ 1，v/v) 稀 释，得内标工作液，质量浓度分别为 1. 0 μg·mL － 1 伏立 康唑 － d3，2. 0 μg·mL － 1 泊沙康唑 － d4。
含药血浆制备 取工作液 10 μL 加入空白血浆 90 μL，涡旋 30 s，得含药血浆 100 μL。分析物在含药 标准曲线血浆中的浓度均为 0. 05，0. 1，0. 2，0. 5，1，2， 5，10 μg·mL － 1 。定量下限和低，中，高浓度血浆质控 样品中分析物的浓度如下，两分析物均为 0. 05，0. 15， 1. 5，8. 0 μg·mL － 1 。
3 血浆样品处理 将血浆 100 μL 置于 1. 5 mL 离心管中，加入内标 溶液 20 μL，涡旋混匀后加入乙腈( 含 0. 1% 甲酸) 1000 μL，涡旋 2 min，4 ℃条件下 1. 5 × 104 r·min － 1 离 心 5 min，吸取上清液进样。
4 方法学考察 专属性 分别取 6 个来自不同健康人的血浆，取空白血浆各 100 μL 作为空白血浆样品; 另取空白血浆加内标工作液作加标空白血浆样品; 再取空白血浆 加入伏立康唑和泊沙康唑对照品工作液配成含药血 浆样品。均按“2. 2”项下方法处理后，进样检测，记录 色谱图，并与含药血浆样本的色谱图进行对比。
标准曲线与定量下限 含药标准曲线血浆按“含药 血浆制备”项制备得到，按“血浆样品处理”项处理，进样分析。待测物的质量浓度为横坐标( x) 进行回归分析，权 重为1/x 2 。以 S/N≥10，同时满足准确度和精密度要求 ( 即用 5 个重复的血浆样品，其精密度的 ＲSD 应在 20 %，偏差在参考值的 ±20 %) 的定量下限( LLOQ) 。
精密度与回收率 取空白血浆 90 μL，加入 10 μL 相应质量浓度的对照品溶液，制成质量浓度分别为 0. 05，0. 15，1. 5，8. 0 μg·mL － 1 的质控样品，每个浓度平 行制备 5 份，按“2. 2”项下方法处理后，进样测定，记录 峰面积，考察批内精密度，并以测得值/真实值 × 100% 计算批内准确度。同法在 3 日内配制并测定 3 批次样 品，考察批间精密度和批间准确度。分别配制低，中，高 质量浓度的质控样品各6 份，其中3 份于提取前加入工 作液，提取后加入内标，另 3 份于提取后加入工作液和 内标，进样分析，计算提取回收率。
稳 定 性 分 别 考 察 质 量 浓 度 为 0. 15，8. 0 μg·mL － 1 的含药血浆在室温下放置 24 h，－ 80 ℃反复 冻融 3 次，－ 80 ℃ 下放置 55 d 及处理后 4 ℃ 下放置 144 h 的稳定性，平行测定 3 次，考察准确度和 ＲSD。
基质效应 分别取 6 个不同来源的空白血浆 90 μL，按“血浆样品处理”项处理，得空白基质后，分 别加入 0. 15，8. 0 μg·mL － 1 质量浓度的对照品溶液 10 μL 及内标溶液 20 μL，制备成基质考察样品，进样 分析，计算伏立康唑与内标峰面积的比值 AQC1 /AIS1，泊 沙康唑与内标峰面积的比值 AQC2 /AIS2 ; 以纯化水取代 血浆，制备同上浓度的伏立康唑及泊沙康唑及内标的 纯溶液，进样测定，计算伏立康唑与内标峰面积的比 值 A， QC1 /A， IS1 及泊沙康唑与内标峰面积的比值 A， QC2 / A， IS2，计算内标归一化基质效应因子( ISMF) = ( AQC / AIS ) /( A， QC /A， IS ) ，并计算其 ＲSD。 结 果 1 方法学评价 专属性 伏立康唑与其内标的保留时间均为 2. 29 min 左右，泊沙康唑与其内标的保留时间均为2. 90 min 左右。空白血浆样品中内源性物质对于伏 立康唑，泊沙康唑及其相对应内标的测定均无干扰， 加标空白血浆样品中对伏立康唑，泊沙康唑的测定也无干扰，专属性较好。见图 1。 标准曲线与定量下限 伏立康唑的回归方程为 y = 7. 332 × 10 － 4 + 3. 799 × 10 － 4 ( r = 0. 997 10) ，检测质量浓度线性范围为 0. 05 ～ 10 μg·mL － 1 ，定量下限 为 0. 05 μg·mL － 1 。泊沙康唑的线性回归方程为 y = 1. 91 × 10 － 3 + 3. 88 × 10 － 3 ( r = 0. 997 22) ，检测质量浓度线性范围及定量下限均与伏立康唑相同浓度。
精密度与回收率 伏立康唑最低定量限，低，中，高 4 个质量浓度的质控样品日内，日间 ＲSD 均小于15%，准确度均在 94. 5% ～ 103. 3%。同样，泊沙康唑 4 个质控， 日间 ＲSD 也均小于15%，准确度在 92. 7% ～99. 2%。在 低，中，高质量浓度下，伏立康唑的平均提取回收率为 68. 1% ～ 78. 0%，泊沙康唑的平均提取回 收率为 71. 6% ～73. 9%。见表1。
基质效应 伏立康唑在低，高两个质量浓度水平 下的内标归一化基质因子 ＲSD 分别为 5. 2% ，3. 0% ; 泊沙康唑分别为 8. 1% ，2. 5% ，均小于 15% ，样品测 定不受基质效应的影响。
2 方法学应用 使用本方法测定 120 例临床样本，分别使用不同 剂量的伏立康唑和泊沙康唑( 除 12 名患者用药泊沙 康唑外，其余均服用伏立康唑) 。伏立康唑检测浓度 均在所设标准曲线范围内，泊沙康唑检测浓度有 2 例 低于定量下限，其余 10 例均在标准曲线范围内，其中 伏立康唑质量浓度为 0. 09 ～ 7. 94 μg·mL － 1，泊沙康 唑质量浓度在 0 ～ 0. 618 μg·mL － 1。据文献［5］可 知，伏立康唑参考有效范围浓度 0. 5 ～ 5. 0 μg·mL － 1。 而泊沙康唑参考有效范围浓度为预防使用 ＞ 0. 7 μg·mL － 1 和挽救治疗 ＞ 1. 0 μg·mL － 1。对于体内伏 立康唑的质量浓度，108 例样本中，92 例在治疗窗 内，10 例 大 于 5. 0 μg · mL － 1，6 例 小 于 0. 5 μg·mL － 1; 对于体内泊沙康唑的质量浓度，12 例 样本均不在治疗窗内。
讨 论 本文采用的 LC － MS /MS 法同时检测临床常用的 两种新型三唑类抗真菌药物。本方法使用的样本量少，专属性好，灵敏度高，准确稳定，符合高通量的检 测需求。适用于临床药物浓度的监测。
参考文献: ［1］ 李力，项迎春，韩奇 . HPLC － MS /MS 法测定人血浆中泊沙康唑 的浓度［J］. 中国临床药理学杂志，2017，1( 232) : 153 － 155. ［2］ 向瑾，余勤，梁茂值，等 . HPLC － MS /MS 测定人血浆中伏立康唑 质量浓度及其生物等效性研究［J］. 四川大学学报，2018，49 ( 1) : 102 － 106. ［3］ 元子青云，陈安九，沈怡雯，等 . 三唑类抗真菌药物临床应用研 究进展［J］. 药学与临床研究，2018，26( 2) : 125 － 129. ［4］ 张素洁，孔贺伟，郭君君，等 . 液相色谱 － 串联质谱法同时测定 血清中 5 个三唑类抗真菌药药物浓度及其治疗药物监测应用 ［J］. 药物分析杂志，2017，37( 6) : 1 038 － 1 045. ［5］ 陈恳，陈耀龙，张相林，等. 伏立康唑个体化用药指南计划书［J］． 药 物流行病学杂志，2017，26( 4) : 289 －293.
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