NLRP3的表达及其炎性体与多种心血管疾病的关系研究

心血管疾病是世界上高发生率和高病死率的疾病之一，NLRP3炎性体是固有免疫的重要组成部分，它识别非微生物危险信号并诱发无菌性炎性反应参与心血管疾病等慢性炎性疾病的发生、发展。在生物医学领域，构建哺乳动物表达载体可以为研究基因的功能提供了实验材料。有研究者构建了人NLRP3真核表达载体并证实融合蛋白在人心肌细胞中定位，为接下来进一步研究NLRP3(核苷酸结合寡聚化结构域样受体3)的生物学活性提供了研究基础。
1、NLRP3的表达载体的构建研究
利用常规转染将质粒载体转到哺乳动物细胞中是使用较为广泛的方法，有研究者以人胎脑cDNA文库为模版，PCR扩增NLRP3全长编码基因，亚克隆至p3×FLAG-cmvTM-10表达载体中。研究者将构建的重组质粒测序并转染到人心肌细胞中(HCM)，提取细胞蛋白进行Western印迹分析检测。利用激光共聚焦扫描显微镜观察FLAG-NLRP3在HCM细胞内定位[1]。该研究者成功构建了FLAG-NLRP3全长基因真核表达载体,FLAG-NLRP3蛋白主要定位于心肌细胞浆内。
为了构建携带小鼠nlrp3蛋白的过表达真核载体，还有研究者首先从高脂饮食喂养3个月的C57BL/6J小鼠上剪取肝脏组织,液氮冻存。快速剪取适量肝脏组织,冰上研磨,Trizol法提取总RNA,逆转录获得cDNA,然后PCR扩增nlrp3基因的编码区。PCR产物电泳回收,经过NotⅠ及NheⅠ双酶切后,将其克隆到真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro中。重组质粒电转进入感受态DH5α,过夜培养后挑取单个菌落过夜扩大培养。然后提取质粒,酶切鉴定后测序。将克隆成功的重组质粒转染HEK293T细胞,培养3d后收集细胞蛋白,用Western印迹分析ting检测nlrp3的表达水平,研究显示,重组质粒pCDH-NLRP3较空白质粒pCDH-NULL的nlrp3蛋白表达水平明显增加。该研究成功构建了nlrp3过表达载体,为进一步研究其作用机制提供了基础工具。
真核表达载体在宿主中以质粒形式存在的，常规质粒转染细胞后，可以产生非常高的拷贝数，使外源基因能高水平表达。哺乳动物表达载体和宿主细胞是哺乳动物细胞表达系统的两个基本组成部分。美迪西科研人员建立了成熟的哺乳动物蛋白表达系统及纯化服务平台，拥有CHO、HEK293、BHK、Vero等多种表达系统，提供哺乳动物蛋白表达系统的表达与纯化服务。
2、NLRP3炎性体与心血管疾病的关系研究
炎性小体由胞浆内模式识别受体参与组装，是一组细胞溶质蛋白复合物，参与了机体的天然免疫系统，能够识别各种应激、外源微生物和内源性危险信号。NLRP3炎性体可识别病原相关分子模式，招募和激活半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)，进而切割白介素(IL)-1β和IL-18的前体，引起炎性反应。NLRP3炎性体介导的免疫通路在冠心病患者中表达异常，介导了冠心病的发展过程。
NLRP3炎性小体在在炎症反应和疾病的发生中起到了重要作用，NLRP3炎性小体主要由NLRP3、含有半胱天冬酶-1补充结构域(ASC)的凋亡相关接头蛋白和效应蛋白pr0-caspase-1。pr0_caspase-1广泛存在于粒细胞、抗原呈递细胞(APc)、巨噬细胞、T细胞和B淋巴细胞上。pro-caspase-1活化后形成caspase-1，进-步可以将IL-1β和IL-18的前体活化成IL-1β和IL-18。此外，caspase-1也被认为参与到细胞焦亡的重要因素之-。
在小鼠模型中观察到NLRP3mRNA水平升高以及心脏肥大、炎性反应和心室扩张，敲除NLRP3基因或使用IL-1受体拮抗剂可以减轻心脏炎性反应，改善心脏收缩功能。
有研究者推测NLRP3炎性体介导的免疫通路参与了冠心病患者心室重塑的发展过程，因为NLRP3炎性体介导的免疫通路是激活IL-1β、IL-18的重要途径[2]。IL-18可引起糖尿病小鼠心肌动作电位时程（APD）延长、K＋电流减少和钙活化增加，进而通过钙调素依赖性蛋白激酶（CaMK）Ⅱ的氧化和磷酸化促进心肌细胞自发收缩；IL-18可能通过促进心肌纤维化参与心衰的发生发展。心室重塑的主要病理生理状态是心脏原有物质和形态学的改变，各类损伤均可引起，其本质是心室的-种适应性、病理性改变。冠心病患者由于冠状动脉阻塞，左心室后负荷增加，导致心室重构。动物研究显示，IL-1β表达水平在心室重塑患者中升高，且与心室重塑有关；另一项临床研究则显示IL-18通过促进心肌纤维化、心室重塑，最终可导致心力衰竭。
与健康成人相比，冠心病患者血清中NLRP3炎性体、ASC、caspase-1、IL-1β及IL-18表达均明显升高，且与心室重塑(平均室壁应力、左室心肌质量指数、左室收缩末容积、左室舒张末容积)均呈正相关。
还有研究发现NLRP3炎性体不仅可介导早期动脉粥样硬化的发生，还可促进易损斑块的形成，调控NLRP3炎性体有助于逆转AS进展和维持斑块稳定性；NLRP3炎性体可介导和放大缺血/再灌注心肌的炎症反应，调控NLRP3炎性体可减轻心肌缺血/再灌注损伤，减少心梗面积；NLRP3炎性体可介导心肌细胞焦亡加重心肌损害，促进心室重塑，调控NLRP3炎性体可改善心脏舒缩功能，抑制心力衰竭的发生发展。
目前NLRP3炎性体有望成为防治心血管疾病的新靶点。近年来，NLRP3炎性体已引起学术界的广泛关注，对于NLRP3炎性体的激活、组装及其介导细胞焦亡的深入机制，药物活性成分对NLRP3炎性体的具体调控机制，NLRP3炎性体在心血管疾病下的变化特点等问题仍有待进-步深入研究。
[1]NLRP3基因真核表达载体的构建和定位[J].
[2]NLRP3炎性体表达水平在冠心病患者心室重塑中的作用[J].