血浆蛋白结合率的经典测定方法之平衡透析法

药物在血浆中会不同程度地与血浆蛋白结合，其结合的程度能够影响药物的体内的吸收、分布、代谢和排泄，进而会影响药物的药效学行为。一般来说，药物在吸收进入血液之后，仅游离的药物能够到达作用部位，产生药理学活性。平衡透析法是基于药物结合的平衡原理来测定药物游离浓度最常用的方法，也是研究药物血浆蛋白结合率的经典方法。

研究发现蛋白质的重要生理和药理功能都需要有药物小分子的参与，药物小分子通过与蛋白质的相互作用可以促进或者抑制蛋白质功能的实现，尤其是药物与血浆蛋白结合会影响到药物的生物学活性。因此药物血浆蛋白结合率的测定对于药物研发较为重要。

1、平衡透析法

药物血浆蛋白结合率是药物在动物体内重要的药理学参数之一，影响着药物体内游离浓度进而影响药物的处置过程。高等动物药物血浆蛋白结合研究已得到长期的发展。平衡透析法可以测定药物血浆蛋白结合率，该法是用透析膜将蛋白质溶液与缓冲液分隔开，建立在两者之间的一种平衡状态，只有分子量小的药物小分子可以通过。透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度与膜的厚度、透析的小分子溶质在膜两边的浓度梯度及透析温度等因素有关。平衡透析法能够直接测出为与蛋白结合的药物小分子的数量，这是分析蛋白与小分子物质结合的关键，从而能够求出结合位点数及结合常数。

2、血浆蛋白结合率对药物的作用

各种药物以一定的比率与血浆蛋白结合之后，在血浆中会同时存在结合型与游离型两种类型，游离性药物具有药物活性。药物与血浆蛋白结合会成为结合型药物，暂时失去药理活性，并且储存于血液中，起到药库的作用，对于药物作用及其维持时间长短具有重要的意义。一般蛋白结合率高的药物体内消除慢，作用维持时间长，药效平稳。结合率低的药物体内消除快，同时作用时间短，药效有很大的波动。

药物内源性性化合物也可在血浆蛋白结合部位发生竞争性置换作用，两种以上的药物联用时，可相互竞争血浆蛋白的结合部位，结合力强的药物能从蛋白结合部位上取代结合力弱的药物，使后者游离型数量增加，导致药效和毒性反应亦增强。其影响程度可因后者在体内的分布容积不同而异。一般只有血浆蛋白结合率高，分布容积小，消除慢以及治疗指数低的药物在临床上的这种相互作用才有意义。血浆蛋白结合率测定属于药代动力学研究内容，美迪西是一家医药研发外包服务公司，在药代动力学体外研究方面有丰富的经验，体外研究是指代谢稳定性、P450诱导和抑制、代谢途径研究、代谢产物鉴定等研究项目，涉及的动物有大鼠、小鼠、兔、狗、猴子等。

3、平衡透析法测定血浆蛋白结合率的应用

如有研究者利用平衡透析法测定了羊耳菊提取物中9个成分的血浆蛋白结合率。研究者采用平衡透析法测定提取物中9个成分血浆蛋白结合率，生物样本用甲醇沉淀蛋白法进行处理，再以葛根素为内标，利用超高效液相色谱-质谱仪串联测定血浆及缓冲溶液中的绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、东莨菪苷、1，3-O-二咖啡酰基奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸等9个成分的浓度[1]。

结果发现在所研究浓度范围内，9个成分呈现良好的线性关系(r≥0.999)，准确度、精密度、提取回收率和稳定性等均符合生物样品测定要求，且并无内源性杂质干扰，表明该文所建立的方法稳定可靠，可用于羊耳菊药材中9种成分在人和大鼠血浆中的血浆蛋白结合率测定。9种成分在人和大鼠血浆中的平均蛋白结合率分别在(41.07±0.046)%～(94.95±0.008)%，(37.66±0.043)%～(97.46±0.013)%。结果表明羊耳菊提取物中9个成分在人和大鼠中的血浆蛋白结合率存在差异。

还有研究者采用平衡透析法模拟化合物LS-177在体内与血浆蛋白的结合过程，采用UPLC-MS/MS方法对透析外液和内液中LS-177的含量进行测定，计算LS-177与大鼠、比格犬和人的血浆蛋白结合率。结果发现所建立的LS-177蛋白结合率测定方法简便、稳定、可靠，LS-177血浆蛋白结合率不具有明显的浓度依赖性和种属差异。

平衡透析法在测定药物血浆蛋白结合率具有操作简单、温度易于控制、PH值可调、设备成本低廉等优点。但是同时存在达成平衡时间较长、溶液体积会变化，且透析时间过长可能会造成由加热或代谢引起的被测物质的降解等缺点。因此在利用平衡透析法测定药物血浆蛋白结合率，或者药物与蛋白质相互作用时需要与其他的一些方法联用，才能获得更准确的作用信息。

[1]平衡透析法测定羊耳菊提取物中9个成分的血浆蛋白结合率[J].

平衡透析法