在药物研发中为什么要检查细菌内毒素

药品在按照既定的工艺生产和正常贮藏过程中可能会产生需要控制的杂质，这些杂质可能会对药品本身的活性、安全性产生影响，还可能会在药物的临床使用中引起不良反应。因此在药品研究中，杂质分析是一项重要的内容，贯穿于新药研发的始终。细菌内毒素属于工艺相关杂质，是蛋白、核酸、多糖等生物大分子纯化过程中令人头疼的杂质之一，它广泛存在试剂耗材和样品之中，是生物医学试验和医药制品的一大污染源，细菌内毒素的检查也成为了药品质量控制的重要检测项目之一。

细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁的一种脂多糖与多种微量蛋白形成的复合体，在细菌死亡或者解体时释放出的具有生物活性的物质，细菌内毒素与热原有关。药品中含有的能够引起体温升高的杂质为热原，热原主要来源于革兰阴性菌的细菌内毒素，人体对于内毒素极为敏感，每毫升血液中掺入皮克级即会引起发热。

内毒素是药品热原检查不合格的主要原因，在GMP条件下，药品生产质量控制的一般可以接受的观点为：无内毒素即无热原，控制内毒素就是控制热原。为了保证生物医学试验的成功率、可靠性，和生物医药制品的安全和有效性，彻底去除样品和溶液中的细菌内毒素备受医药研发人员的关注。

由于细菌内毒素可以使一种海洋生物鲎的血细胞溶解物迅速发生凝集反应，由此衍生了以鲎血的提取物LAL/TAL试剂为基础的多种高灵敏度的细菌内毒素检查法。2010年版《中国药典》中规定，细菌内毒素检查法是利用鲎试剂来检测内毒素或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。在采用LAL/TAL试剂检测内毒素的方法中，凝胶法、浊度法和比色法被各大生物行业认可并广泛应用。比色法和浊度法用于杂质分析，可以利用杂质特有的呈色反应(比色法)和沉淀反应(比浊法)与标准对照。然而制备LAL/TAL试剂需要捕杀稀有动物鲎，其他的需要使用LAL/TAL试剂来检测内毒素的方法如酶联免疫吸附测定法、流式细胞法等陆续上市。那么用于检测细菌内毒素的方法主要有哪些呢？

1、凝胶法

凝胶法是利用鲎试剂来量化检测革兰阴性菌所产生的细菌内毒素，将待测样品与鲎试剂混合，一段时间后通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。该方法操作简便且成本低，但是自动化程度也低，较为耗时，且容易出现假阳性的情况。凝胶色谱、溶胶-凝胶法都属于杂质分析方法。

如有研究者采用凝胶法建立苯磺顺阿曲库铵注射液的细菌内毒素检查方法[1]。方法参考2015年版《中国药典(四部)》细菌内毒素检查方法，通过试验验证苯磺顺阿曲库铵注射液对细菌内毒素检查的抑制作用，用稀释剂Ⅰ代替细菌内毒素检查用水(WBET)稀释供试品能消除苯磺顺阿曲库铵注射液对内毒素检查的抑制作用。结果补充适量的二价离子可有效消除苯磺顺阿曲库铵注射液对细菌内毒素检查的抑制。结论该品最大不干扰浓度为0. 02 g/L，可采用凝胶法对苯磺顺阿曲库铵注射液细菌内毒素进行控制。美迪西提供药物杂质分析服务，可以利用HPLC等各种技术分离监管起始原料、中间体、API和药物产品中的杂质。

2、浊度法

浊度法是通过细菌内毒素结合鲎试剂的C因子，激活凝固酶形成凝固蛋白，从而产生浊度变化。作为一种杂质分析方法，浊度法分析技术还可以用来帮助研究晶体中杂质的来源和杂质对红外吸收和色心激光的影响。

根据测量方式的不同，浊度法又分为终点法和动态法。浊度法检测细菌内毒素操作简单，不受试验环境的影响，具有灵敏度高、检测范围广的特点。但是浊度法需要配备专用仪器。

如有研究者采用浊度法探讨湿润烧伤膏经正己烷萃取后水溶液的细菌内毒素检查方法[2]。方法采用外加定量内毒素接种法，将烧伤膏内毒素从油相中萃取到水相中，用动态浊度法测定内毒素回收率，考察萃取过程中对内毒素的影响；同时用凝胶法对不干扰浓度做进一步验证。结果萃取液稀释6倍后的内毒素回收率为52.3%且对鲎试剂反应无干扰，两种方法检测萃取液中内毒素的结果均在规定限值内。结论湿润烧伤膏用正己烷溶解后，与细菌内毒素检查用水充分振荡混匀，取水相萃取液进行细菌内毒素检查是可行的。

3、比色法

比色法是根据细菌内毒素激活的凝固酶水解鲎三肽，释放出黄的对硝基苯胺，通过检测吸光度，或者通过对释放的对硝基苯胺与偶氮试剂反应形成的红色偶氮蓝复合物进行检测。

虽然比色法操作较为复杂，但是灵敏度与精度较高，适用于在重组蛋白质药物的内毒素检测。

4、酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法根据细菌内毒素刺激巨噬细胞会产生内源性致热原，如TNF、IL-1等，通过检测这些内源性致热原而对内毒素进行定量检测。这种方法操作简单，可重复性强，但是操作较为繁琐，且糖类成分会刺激细胞产生内毒素干扰检测，尚须排除糖成分的干扰，检测精度方面不如鲎试剂法。

5、流式细胞法

流式细胞法是使用针对内毒素表面抗原的单克隆抗体，对内毒素进行荧光标记，然后使用流式细胞仪进行检测，该方法不需要依赖内毒素活性，可以直接检测内毒素含量。

进行药物杂质分析，对药物中的杂质进行规范检测和合理控制，关系到药品的安全和有效性。作为药品质量控制的重要检测项目之一，细菌内毒素检测法在保障临床用药安全方面起到了非常的重要的作用。细胞内毒素的检测方法有很多，在确定检测方法时应进行科学的验证，并逐步完善检测方法的验证工作。

[1] 苯磺顺阿曲库铵注射液细菌内毒素检查法研究[J].

[2] 烧伤膏细菌内毒素检查方法学研究[J].