【前沿速递】被忽视了的厌氧菌耐药—碳青霉烯类耐药脆弱拟杆菌

由于临床厌氧培养标本送检意识和实验室重视程度不足、特殊培养基及设备配置不足等因素，国内许多微生物实验室厌氧培养开展不充分，厌氧菌分离率明显低于其他临床常见病原菌。常规开展厌氧菌药敏试验的实验室更为有限。因此，对于厌氧菌感染病例，临床医师多经验使用甲硝唑等药物进行治疗。但最近一些研究显示，多重耐药厌氧菌特别是碳青霉烯类耐药脆弱拟杆菌在全球各地不断出现，且检出率呈不断增加趋势。本文将对近年来不同国家和地区碳青霉烯类耐药脆弱拟杆菌的分离情况进行汇总和分析，为临床医师和实验室人员更好了解真实的厌氧菌耐药趋势提供参考数据。1.厌氧菌临床分布特征厌氧菌是人体皮肤和黏膜正常菌群的主要组成部分，同时也是内源性细菌感染的常见病原菌。从目前的文献报道来看，几乎人体所有部位都可以发生厌氧菌的感染。根据对氧分压耐受程度的不同，厌氧菌可进一步划分为极端厌氧菌、中度厌氧菌和耐氧厌氧菌。极端厌氧菌在临床样本中很难分离到，临床标本中分离率最高的是中度厌氧菌（如产气荚膜梭菌和脆弱拟杆菌）和耐氧厌氧菌（如第三梭菌和溶组织梭菌）。其中，脆弱拟杆菌是目前文献报道中临床分离率最高的一种革兰阴性无芽孢厌氧菌，属于拟杆菌属的一员，是导致内源性厌氧菌感染的重要成员。与其他拟杆菌属厌氧菌相比，多重耐药株及碳青霉烯类耐药株主要出现在脆弱拟杆菌。2.厌氧菌药敏试验按照CLSI M100文件要求，目前用于厌氧菌药敏试验的方法包括琼脂稀释法和微量肉汤稀释法，但微量肉汤稀释法仅推荐用于检测脆弱拟杆菌群。质控菌株可选择脆弱拟杆菌ATCC25285或多形拟杆菌ATCC29741，以ATCC25285菌株应用最为广泛。2.1 测试药物选择常用于拟杆菌群药敏试验的药物包括阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、克林霉素、厄他培南、亚胺培南、美罗培南和甲硝唑，补充试验的药物可选择青霉素、氨苄西林、头孢替坦、头孢西丁、头孢唑肟、头孢曲松、氯霉素或莫西沙星。CLSI指南尚无针对厌氧菌纸片扩散法的判断折点。2.培养基和培养条件琼脂稀释法选用布氏琼脂，微量肉汤稀释法选择布氏肉汤，琼脂或肉汤中需要添加血红素、维生素K1和细胞裂解羊血或马血，接种好菌液的平板或肉汤置于厌氧环境中培养42-48小时（琼脂稀释法）或46-48小时（微量肉汤稀释法）。3.脆弱拟杆菌碳青霉烯类耐药机制依据目前文献报道，脆弱拟杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的机制主要是产生金属-β-内酰胺酶(MBLs)，表现为对β-内酰胺酶抑制剂的广泛耐药，包括克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦。按照Ambler分类，金属-β-内酰胺酶归属于B类，脆弱拟杆菌金属酶编码基因主要是cfiA基因。研究人员对cfiA基因介导脆弱拟杆菌的的耐药机制进行了进一步研究。1991年，一个被命名为IS942的基因序列被发现位于1株碳青霉烯类耐药脆弱拟杆菌cfiA基因的上游位置，这一插入序列(insertion sequence，IS)被推断为与cfiA基因转录启动有关[1]。随后，IS1186和IS4351[2,3]两个插入序列陆续被发现，2个IS序列也紧靠cfiA基因上游位置。后续发现的插入序列IS1187和IS1188，也同样被证实与cfiA基因表达活化有关。只携带cfiA基因而无上游插入序列的菌株，通常不具备碳青霉烯类耐药特征。但也有研究发现，cfiA基因缺失[4]及cfiA基因阳性但IS序列缺失的脆弱拟杆菌[5]也可表现为碳青霉烯类耐药或亚胺培南MIC值升高，具体机制尚不明确。4.不同国家和地区耐药特征4.1 欧洲：2011年，来自欧洲的一项多中心研究显示，脆弱拟杆菌群对亚胺培南耐药率由20年前的0%上升至1.2%，非敏感株（亚胺培南MIC≥4μg/mL）比例由0.3%增加至2.7%[6]。2017年丹麦的一项研究显示，359株脆弱拟杆菌群菌株对美罗培南耐药率达5%[7]；而来自于荷兰的一项最新研究发现，5.3%（2/38）脆弱拟杆菌对美罗培南耐药；38株测试菌株中，6株携带cfiA基因，2株对美罗培南完全耐药，4株呈现中介耐药；同时携带cfiA基因和IS序列的菌株对美罗培南耐药程度最高(MIC>32μg/mL)[8]。4.2 美国：与欧洲的结果相似,一项多中心研究显示，脆弱拟杆菌对碳青霉烯耐药率由1997-2004年间的0.5%上升到2008-2009年间的2.5%[9]。4.3 亚洲：2012年来自韩国的一项多中心研究显示，脆弱拟杆菌对亚胺培南和美罗培南耐药率为4%和6%[10]；2014年中国台湾的一项研究数据显示，141株脆弱拟杆菌对厄他培南、亚胺培南和美罗培南耐药率分别高达13.5%、8.5%和9.9%[11]；3家伊朗医院收集的132株脆弱拟杆菌对美罗培南耐药率达13.6%（18/132）[12]。我国胡付品老师近期在在《International Journal of Antimicrobial Agents》上发表的数据[13]显示，44株脆弱拟杆菌对亚胺培南、美罗培南和厄他培南的耐药率高达18.2%、29.5%和22.7%；同时，研究还发现碳青霉烯类耐药脆弱拟杆菌cfiA基因上游IS序列可通过上调cfiA基因表达增加碳青霉烯类抗生素的耐药性，与目前已知碳青霉烯类耐药机制相同。我们团队的研究结果[14]显示，54株脆弱拟杆菌对亚胺培南耐药率分别达到39.98%(25/65)，cfiA基因携带率高达52.31%(34/65)。与欧洲和美国的数据相比，亚洲地区碳青霉烯类耐药脆弱拟杆菌分离率最高。5.脆弱拟杆菌碳青霉烯类耐药株的快速检测DNA-DNA杂交实验可将脆弱拟杆菌划分为两个亚群，I群和II群。群间和群内同源性达65-70 % 和90%。核糖体分型技术或多位点酶电泳法等分子分型方法可对I群和II群菌株进行区分和鉴别，但这些方法对实验室技术平台要求较高，不易于临床实验室常规开展。近期有研究显示，cfiA基因阳性脆弱拟杆菌株可通过一步突变由碳青霉烯类敏感株转变为碳青霉烯类耐药株[15]；而且，cfiA基因主要在II群脆弱拟杆菌中能够检测到。这些研究结果提示：实验室可通过筛查脆弱拟杆菌cfiA基因携带情况来快速识别耐药株或非耐药株。Nagy E等[16]发现，通过MALDI-TOF MS技术可快速区分cfiA阴性及cfiA阳性菌株，质谱峰的差异主要体现在4000-5500 Da区间内。但该研究选用的菌株数量有限（40株），仍需收集更多菌株对这一结论进行验证和确认。如该结论成立，实验室将能快速识别潜在高水平耐药株，为临床选择合适抗生素提供及时的数据支持。此外，碳青霉烯耐药株常表现为多重耐药特征。因此，我们应对脆弱拟杆菌耐药性给予更多关注和重视，以更客观了解其耐药特性，更有效指导临床抗厌氧菌感染的药物选择。6.参考文献[1] Rasmussen BA, Kovacs E.Identification and DNA sequence of a new Bacteroides fragilis insertion sequence-like element. 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国内很少数据

脆弱拟杆菌可选硝基咪唑类，或者替加环素