美国临床实验室标准委员会推荐药敏试验操作方法和判断标准

世界大多数国家地区采用美国临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的药敏试验操作方法和判断标准。2005年该委员会更名为临床试验标准研究所(CLSI) ,考虑到大多数国家地区的习惯,在过渡时期暂时称为CLSI/NCCLS,其相应的标准改称为CLSI文件。
CLSI/NCCLS-M100药敏测定指南为适应临床实际工作的需要,每年都会依实际情况加以更新和修订。2005 版CLSI/NCCLSM100-S15的主要增补内容包括药敏试验培养
温度、达托霉素药敏试验和报告、药敏试验质量保证菌株的使用、β-溶血链球菌克林霉素诱导耐药的检测、产超广谱β内酰氨酶菌株( ESBL)筛选试验及确证试验在奇异变形杆菌中的应用、脑膜炎奈瑟球菌的药敏试验等内容。本文就相关内容予以介绍,以使国内业界同行们对此有一定的了解。
一、药敏试验培养温度的规定
1.葡萄球菌属33～35℃,不要超过35℃。其原因是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和MRCNS的鉴定在超过35℃时存在假阳性问题。
2.其他细菌的药敏试验培养温度在35℃ ±2℃。
二、达托霉素( dap tomycin)
达托霉素是由美国礼来公司最初研究, Cubist制药公司开发的一环脂肽类抗生素。2003年底,美国食品与药品管理局经过快速审理程序批准注射用达托霉素用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌引起的并发性皮肤感染及皮肤感染。达托霉素的作用机制与其他抗生素不同,它通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运,从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成。此外,它还能通过破坏细菌的细胞膜,使其内容物外泄而达到杀菌的目的。达托霉素对葡萄球菌和肠球菌的判定标准见表1。
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达托霉素仅限于对葡萄球菌、肠球菌和β溶血链球菌的药敏试验,当出现非敏感结果时,应重新鉴定菌种和重复药敏试验。值得注意的是纸片扩散法很难发现对达托霉素敏感性降低的葡萄球菌最低抑菌浓度(M IC > 1μg/ml)和肠球菌(M IC > 4μg/ml) ,临床治疗的失败可能由于纸片扩散法判定为“S”菌株,而实际上对达托霉素敏感性降低。
三、药敏试验的质量控制( quality control, QC)和质量保证( quality assurance,QA)菌株
纸片扩散法中, 最常用的质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922,金黄色葡萄球菌ATCC25923和铜绿假单胞菌ATCC27853。测定M IC 最常用的菌株为大肠埃希菌ATCC25922,金黄色葡萄球菌ATCC29213和铜绿假单胞菌ATCC27853。在检测产超广谱β2内酰胺酶菌株时,必须增加肺炎克雷伯菌ATCC700603作为质控菌株。
每日或每周进行质控试验可以保证得到准确的结果。当质控结果可以接受时说明药敏试验所使用设备、试剂、培养基及耗材和试验过程是符合要求的。如在“D”试验使用金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控菌株。
使用ATCC菌种进行质量保证,其目的是训练操作人员如何准确地进行药敏试验并得到可靠的结果,保证每个操作者具有正确进行药敏试验的能力。同时,还可用以评价结果的准确性。如2005版CLSI/NCCLS在“D”试验中增加QA菌株金黄色葡萄球菌ATCCBAA-976 (msrA)和金黄色葡萄球菌ATCCBAA-977 ( ermA) ,分别作为“D”试验阴性和阳性结果的对照。
对产ESBL筛选和确证试验时也应加强质控和质保菌株的试验(表2) 。
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由于肺炎克雷伯菌ATCC700603的ESBL基因存在于质粒上,因此应保存该菌在- 60℃或者更低的环境下。
四、革兰阴性肠杆菌科细菌的增补内容奇异变形杆菌-ESBL试验:奇异变形杆菌产ESBL 菌株在美国罕见,有报道在171 株奇异变形杆菌中仅1株为产ESBL株。因此, 2005版CLSI/NCCLS并不推荐对奇异变形杆菌进行常规ESBL筛选试验。但在某些地区如欧洲、南美等地,产ESBL的奇异变形杆菌分离率较高,常引起医院感染的暴发。
当从患者无菌部位分离到奇异变形杆菌,特别是当奇异变形杆菌所引起的菌血症时,有必要与临床医生商议进行ESBL试验。2005版CLSI/NCCLS所规定的奇异变形杆菌的ESBL筛选试验与大肠埃希菌、产酸和肺炎克雷伯菌筛选试验有所不同,其中头孢泊肟的M IC值为≥2μg/ml。确证试验的判定标准与大肠埃希菌、产酸和肺炎克雷伯菌的相同。奇异变形杆菌ESBLS筛选试验的判定标准见表3。
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五、非发酵菌的增补内容
2005版CLSI/NCCLSM7 (M IC)表建议对不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌和嗜麦芽窄食单胞菌(不包括铜绿假单胞菌)可常规进行以下药物的敏感性试验,包括替卡西林/克拉维酸、复方磺胺甲噁唑、头孢噻肟或头孢曲松、氯霉素、头孢唑肟和四环素。而头孢唑肟和四环素仅限于尿道分离株的M IC试验。
近年来,多重耐药的鲍曼不动杆菌使临床抗感染治疗面临严峻的挑战。对于庆大霉素、阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、多西环素、环丙沙星、复方磺胺甲噁唑均表现为耐药的鲍曼不动杆菌,需要加强临床医生与临床微生物人员的沟通、会诊;咨询国家参考实验室的临床微生物学专家;加做其他药物的敏感试验,如多粘菌素-E和多粘菌素-B。多粘菌素-E和多粘菌素-B的质控范围见表4。
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值得注意的是: (1)多粘菌素B的折点可用以推断多粘菌素E的结果, ≤2μg/ml为“S”、≥4μg/ml为“R”; ( 2)可向临床医生报告多粘菌素B的结果,并附可作为多粘菌素E的参考依据的意见; (3)多粘菌素纸片扩散法不能鉴定某些耐药株(主要是嗜麦芽窄食单胞菌和不动杆菌) ; ( 4) 铜绿假单胞菌对多粘菌素的耐药株罕见。
六、葡萄球菌的增补内容
1. mecA基因介导耐药2004年NCCLS曾建议用30μg头孢西丁纸片代替1μg苯唑西林纸片检测甲氧西林耐药的葡萄球菌(MRS) ,其意义在于mecA基因在高浓度头孢西丁
存在的条件下比苯唑西林更易表达。
检测mecA基因和青霉素结合蛋白2a ( PBP2a)是确证耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)最准确的方法。虽然非mecA基因介导耐药的
机制罕见,但确实存在。因此,在纸片扩散法确定为耐药,加做苯唑西林M IC,当≥4μg/ml时,即使mecA基因和PBP 2a检测为阴性,也要报苯唑西林耐药。
对于表皮葡萄球菌头孢西丁和苯唑西林的纸片扩散法和苯唑西林M IC的判定标准是合适的,但对于其他凝固酶阴性葡萄球菌, 如腐生葡萄球菌、路邓葡萄球菌
( slugdunensis)等菌种,该判定标准常造成耐药率过高。因此, 2005版CLSI/NCCLS对路邓葡萄球菌苯唑西林的判定标准是使用金黄色葡萄球菌的标准(表5) 。
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金黄色葡萄球菌mecA基因介导耐药的检测方法,依次为mecA、PBP2a、头孢西丁纸片法、苯唑西林纸片法或苯唑西林M IC。临床微生物室常规试验结果可确定为,头孢西丁纸片法=苯唑西林纸片法=苯唑西林M IC结果。凝固酶阴性葡萄球菌mecA基因介导耐药的最好方法为mecA和PBP2a检测,常规试验中头孢西丁纸片法优于苯唑西林纸片法和M IC法(表6) 。如果苯唑西林M IC判定为耐药菌株加做头孢西丁纸片法可消除假阳性,提高特异性。
对于苯唑西林纸片检测中介的金黄色葡萄球菌必须进行mecA基因检测、PBP2a检测、头孢西丁纸片法、苯唑西林高盐琼脂筛选试验或苯唑西林M IC测定,来确定是否为MRSA菌株。
2. 万古霉素中介和万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌(VISA /VRSA)的检测近年来VISA /VRSA已引起有关人员的普遍关注, 2005版CLSI/NCCLS推荐的方法见表7。
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3. 葡萄球菌对某些氟喹诺酮药物的判定标准的改变分别调整了葡萄球菌对氧氟沙星、加替沙星和左氧氟沙星纸片扩散法和MIC的判定标准,同时增加了莫西沙星的MIC标准, (表8、9) 。


七、B群链球菌的大环内酯类耐药机制的检测
2004版NCCLS推荐了葡萄球菌属大环内酯类耐药机制的鉴别方法, 2005版CLSI/NCCLS又将这一检测方法应用于β2溶血链球菌(包括A、B、C、Gβ-溶血链球菌) 。
β-溶血链球菌的大环内酯类耐药机制主要为mef基因编码的泵出机制、核糖体结构型变异、核糖体可诱导变异三类。后两类均为erm基因编码,可使23S rRNA甲基化,第三类又称为MLSb 耐药(M =大环内酯类, L =林可霉素, Sb =链阳霉素B型) 。“D”试验又名克林霉素诱导试验,在进行常规药敏试验时,将红霉素纸片(15μg/片)和克林霉素纸片(2μg/片)贴在邻近的位置,间距(边沿到边沿) 12 mm、35℃±2℃培养20～24 h。如靠近红霉素纸片处克林霉素的抑菌环减小,呈英文大写的D型,则判定为“D”试验阳性。为保证试验结果的可靠性,“D”试验应同时进行QC菌金黄色葡萄球菌ATCC25923和QA菌金黄色葡萄球菌ATCC BAA-976(msrA)和ATCCBAA-977 ( ermA)的药敏试验。
B群链球菌是引起妇女妊娠期和围产期感染的重要病原菌,对于分娩期和围产期妇女预防性用药,推荐使用青霉素和氨苄西林。但对青霉素过敏的高危者,建议使用克林霉素或者红霉素。因此,当从对青霉素过敏的妊娠妇女分离到B群链球菌时,应进行克林霉素和红霉素的“D”试验。克林霉素呈诱导耐药的菌株感染者,其中部分使用克林霉素治疗是有效的,但临床医生应予以注意。
八、脑膜炎萘瑟球菌的M IC微量肉汤稀释法2004年底和2005年初,由脑膜炎奈瑟球菌所致的脑膜炎的暴发流行引起了社会普遍的关注。2005 版CLSI/NCCLS增补脑膜炎奈瑟球菌的药敏试验对于控制和预防细菌性脑膜炎具有重要意义。脑膜炎奈瑟球菌的M IC微量肉汤稀释法的操作程序是从巧克力平板(20～24 h生长物)制备菌悬液,使用含2%～5%裂解马血的调节过阳离子的MH肉汤,在5% CO2 环境, 35℃培养20～24 h观察结果。质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619,并根据试验药物选择大肠埃
希菌ATCC25922作为质控菌。
治疗由脑膜炎奈瑟球菌引起的脑膜炎的抗生素有青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、美洛培南和氯霉素。对密切接触者可预防性应用的抗生素有阿奇霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、米诺环素、利福平、磺胺异噁唑、复方磺胺甲噁唑。
脑膜炎奈瑟球菌产β内酰胺酶株罕见,对青霉素中介和耐药主要是青霉素结合蛋白的改变。对预防用抗生素的耐药,磺胺异噁唑较常见,而环丙沙星少见。

多谢多谢！我的问题原来早有同仁给我备好了答案。先我多步，向你学习！